神经干细胞的研究进展摘要：本文主要论述神经干细胞的两个应用方面，诱导神经干细胞分化与神经再生。

诱导神经干细胞的分化有两种办法，分别为直接诱导法和间接诱导法。

与iPSCs相比较，iNSCs拥有更大的优势。

神经再生主要从细胞微环境方面论述，包括周围细胞，细胞因子，细胞外基质及微血管因素。

关键词：神经干细胞；诱导分化；细胞再生；微环境1.引言神经干细胞(neural stem cell)是指存在于神经系统中，能够分化形成多种脑细胞，并能够自动更新，提供大脑组织细胞的细胞群[1]。

其具体能分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

大量研究表明，许多疾病如帕金森病，亨廷顿舞蹈症，脊髓损伤及认知功能[2]等均与神经干细胞相关，能被其治愈或者是由于神经元病变所引起的。

2006年Yamanaka利用小鼠成纤维细胞成功获得iPSCs[3]，这一研究使干细胞的研究发展进入了全新的局面，随之而来的多项研究成功建立了利用iPSCs治疗相关疾病的细胞模型及动物模型，但仍存在一定的问题需要解决。

治疗这些疾病利用了神经再生，这在成年哺乳动物的两个脑区终生存在, 分别是海马齿状回的颗粒细胞层(subgranular zone,SGZ)和侧脑室的视管膜下区(subventricular zone,SVZ),主要包括神经干细胞的增殖、迁移、分化及新生神经元整合至神经环路四个阶段。

这阐明影响神经干细胞增殖分化的因素对于深入认识神经再生的相关机制至关重要。

神经干细胞的增殖分化等行为高度依赖于其生长环境, 即神经干细胞微环境(niche)。

神经干细胞niche的组成在两个神经再生的脑区有一些差异, SVZ 区niche 的细胞主要包括室管膜细胞、星形胶质细胞、短暂增殖细胞和神经母细胞。

SGZ区niche 细胞主要包括星形胶质细胞、增殖细胞和神经元。

神经干细胞niche 对神经干细胞增殖分化的调控主要包括: 与神经干细胞相邻的周围细胞的调控、细胞因子调控、细胞外基质调控及微血管调控。

2.相关研究进展2.1iPSCs与iNSCs的相关研究2.1.1 iPSCs的优劣性iPSCs在基础研究和细胞替换治疗方面存在较大优势，对它的应用能够避免伦理问题，并且其个体唯一的遗传信息使得研究者能够制备病患自体的iPSCs来研究遗传方面问题，此外使用该方法不存在异体排异方面的问题。

但iPSCs在深入研究后仍然显现出较多应用的局限性，如转换效率底下，致瘤风险等。

2.1.2 iNSCs的研究进展体细胞直接重新编程，也称诱导转分化，即将一种已分化细胞直接转换为另一种已分化细胞类型而不经过iPSCs阶段。

该方法近年已被证明能够快速且高效地产生诱导型神经干细胞（iNSCs）。

该方法主要是在成体细胞中直接转入神经干细胞表达的某些相关基因，使其直接重编程为神经干细胞。

Lujan等[4]报道转入11个神经干细胞相关的外源基因可以将小鼠成纤维细胞诱导成神经干细胞，该细胞在体外可以分化出星形胶质细胞，少突胶质细胞及成熟神经元，并能在体内存活。

Sheng C等[5]转入Ascll、Ngn2、Hes5等9个神经干细胞相关基因将小鼠睾丸支持细胞诱导成神经干细胞，该细胞在体外能分化出多巴胺能神经元，胆碱能神经元及神经胶质细胞。

Han等报转入Brn4、sox2、klf4、c-Myc、E47基因或转入Brn4、sox2、klf4、c—Myc均将小鼠成纤维细胞诱导为神经干细胞，诱导神经干细胞能在体外在传代130次以上，且与野生型神经干细胞形态，基因表达，十分相似。

研究还发现转入4因子与5因子诱导的神经干细胞与野生型神经干比较，同样有成熟的分化能力，可分化出星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞。

Ring等用逆转录病毒载体携带sox2转染小鼠成纤维细胞，6～10d后就出现神经干细胞克隆。

而转染人成纤维细胞后，5d内就出现了神经干细胞克隆，将诱导神经干细胞与野生型神经干细胞同时移植免疫缺陷小鼠，没有肿瘤形成，证明诱导神经干细胞的安全性。

另一种方法是体细胞经过iPSCs中间态诱导为神经干细胞。

Kim等[6]使用Dox 载体系统在小鼠成纤维细胞中转入oct4、sox2、klf4、c—myc基因，在含有LIF 的MEF上培养3～6d后继续在神经干细胞培养基中培养8～9d，将会有表达plzf、pax6等神经干细胞标志的克隆出现，这种“类似神经干”细胞，可以继续分化出星形胶质细胞、神经元，但是此种干细胞在体外只能扩增3～5代。

裴端卿等[7]使用非整合载体oriP／EBNA episomal携带oct4、sox2、sv40h、klf4和microRNA302—367电转人尿液中提取的活细胞，然后在神经干细胞培养基中加入CHIR99021、PD0325901、A83-01、Thiazoviv、DMH1，电转后12d可见神经干细胞克隆出现，且能表soxl、sox2、pax6等神经干细胞标志性基因，诱导的神经干细胞能分化成星形胶质细胞，多巴胺能神经元，谷氨酸能神经元，但是不能自然分化为少突胶质细胞，在使用PDGF—AA、NT3等小分子刺激后，可以分化出少突胶质细胞。

同时，将诱导神经干细胞移植人新生小鼠纹状体后，神经干细胞能够存活，迁移，脑内没有形成肿瘤，证明诱导神经干细胞的体外分化能力及安全性。

另外，除了成纤维细胞做为供体细胞外，LohY．HStaerk，JDoweySN 等使用外周血中的T细胞或单个核细胞成功诱导出iPSCs，免去了获取成纤维细胞的侵袭性操作，这也提示了使用外周血单核细胞诱导神经干细胞的可能性。

2.2 对神经干细胞的调控当神经干细胞周围环境的细胞类型不同时,由于细胞间的相互作用,使得神经干细胞的命运也存在显著差异。

与神经干细胞相邻的周围细胞主要包括星形胶质细胞和室管膜细胞,它们均对神经干细胞的增殖、迁移、分化和成熟起关键作用。

2.2.1 周围细胞的调控周围细胞能够对神经干细胞进行调控。

星型胶质细胞可促进神经干细胞的增殖和分化[8]。

研究发现,星形胶质细胞可以分泌hevin和SPARC两种蛋白,其中hevin可以正向调节突触形成,相反,SPARC则负向调节。

因此,星形胶质细胞可通过这两种蛋白来调控突触的形成、成熟和可塑性。

阻断星形胶质细胞中的囊泡释放,可以导致新生神经元的树突棘密度降低,这种现象发生在与星形胶质细胞接触的神经元上,由于星形胶质细胞的突触前鞘覆盖了成年大脑中的大部分突触,所以星形胶质细胞很可能在成年嗅球部位的突触形成、维持和消除中起重要作用。

另一种室管膜细胞同样可以进行调控。

室管膜细胞沿脑室排列,并作为脑脊液的过滤系统调控离子和小分子物质的转运,为脑脊液提供屏障。

室管膜细胞主要可以产生Noggin,这是一种BMP信号拮抗剂。

BMP在人胚胎和成年神经系统中均高度表达,在神经再生过程中,BMP可以促进神经干细胞向胶质细胞方向分化,抑制其向神经元方向的分化。

星形胶质细胞可表达BMP配体及其受体,体内外实验证实,Noggin可以增加海马神经干细胞的增殖,促进其向神经元方向的分化,从而增加成年海马部位的神经再生,同时这也说明,星形胶质细胞、室管膜细胞和神经干细胞之间存在复杂的多细胞相互作用。

2.2.2 细胞因子的调控生长因子可维持并促进细胞在各种生物环境中的生长[9]。

研究证实,EGF、bFGF、胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)均参与调节成年大脑中的神经再生[10]。

这些生长因子具有共同的信号传导机制,可以与酪氨酸激酶家族的特异性受体结合。

与受体结合的生长因子导致各自受体的胞内结构域磷酸化,进而激活下游信号传导途径,包括PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/Erk途径。

神经营养因子是细胞外信号蛋白,在中枢神经系统发育中起着重要的作用。

在哺乳动物中,已经鉴定出4种神经营养因子,即NGF、BDNF、NT-3和神经营养因子-4/5(neurotrophin-4/5,NT-4/5)。

神经营养因子结合受体酪氨酸激酶(tyrosine kinase,Trk)发挥其生理功能。

三种不同的Trk,即TrkA、TrkB和TrkC对不同的神经营养因子具有不同的优先结合力。

NGF优先结合TrkA,BDNF和NT-4/5结合TrkB,而NT-3结合TrkC。

2.2.3细胞外基质的调控神经干细胞niche的细胞外基质(extracellular matrix,ECM),是由细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子组成的,主要包括各种糖蛋白和黏蛋白。

这些物质构成复杂的三维网架结构,支持并连接组织结构,通过调节结合在基质上的各种细胞因子,从而调节神经干细胞的增殖、黏附、迁移和分化。

成年SVZ含有丰富的腱生蛋白-C、胶原蛋白-1、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、硫酸软骨素蛋白聚糖和整合素,这些均参与神经干细胞的增殖和迁移。

2.2.4 微血管因素的调控血管也是神经干细胞niche的组成部分,神经干细胞并非在脑内随机分布,而是主要分布在血管丰富的部位。

许多生长因子和神经营养因子,如BDNF和VEGF,不仅可以促进神经再生同时也可以促进血管再生,这也表明神经再生和血管再生之间存在协同调节。

血管内皮细胞可以合成多种在神经再生中起重要作用的细胞质基质成分和生长因子。

3．结束语神经干细胞的应用前景及应用方式十分多样化，前文提及的iPSCs和iNSCs 均在神经干细胞这一领域具有极高的研究价值。

诱导神经干细胞研究主要集中在如何缩短体细胞转分化的周期及提高转分化效率，以及外源因子载体的安全性，移植治疗的有效性。

另外，病变部位细胞原位转分化为神经干细胞以起到治疗作用也是很有意义的研究方向。

而神经再生是当前神经科学领域最具潜力的研究领域之一,神经干细胞的调控与其微环境密切相关。

近年来,随着基因敲除、神经成像、蛋白质组学和基因组学等技术的发展,使研究者对神经干细胞niche有了更加全面的了解,但是,对于其中细胞和分子组分间确切的相互作用机制的认识仍然具有一定的局限性。

随着对该领域的深入研究,神经干细胞的自我更新、增殖、迁移和分化等分子调控机制将会得到进一步的阐明,这将对干细胞移植和再生医学起到极大的推进和鼓舞作用,同时也可以为脑损伤疾病的临床治疗提供新的选择。

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