Construction of pWAV2-TH
T7
Hind III Kpn I BamH I BstX I TH EcoR I EcoR V BGH PA BstX I Not I Xho I Xba I f1ori Apa I
P CMV
CMV ITR
Ampr
pcDNA3 -TH
SV40AP
Kpn I EcoR I Sma I Sal I Bgl II
神经干细胞研究进展
报告内容提要
国内外研究现状
骨髓源神经干细胞的横向分化 骨髓源神经干细胞致瘤性研究 骨髓源神经干细胞的活体示踪
一、国内外研究现状
神经干细胞的概念
神经干细胞是指来源于神经组织及神经
组织的发源地、终生保持自我更新能力，
并能分化为各种神经组织细胞的一类细胞 称为神经干细胞。
神经干细胞的研究概述
NESTIN免疫磁珠法分离
大鼠神经干细胞（箭头）
a
b
c
丫啶橙荧光染色鉴定大鼠神经干细胞及分化细胞活力情况（a,b）.
NESTIN免疫磁珠标记的大鼠神经干细胞（c）。
NSCs提纯后流式细胞仪检测结果。a 同型对照；b 阳性
Result of flow cytometry at post-purification . a Immunomagnetic beads-free; b With immunomagnetic beads
3
M
1
2
Control
大鼠NSCs提纯后RT-PCR法鉴定神经干细胞不同蛋白表达。
1:BF-1 ；2:TH ；3:GABA ； M：分子量标记； Control:PBS对照
a
b
c
d
大鼠骨髓基质细胞。0h（a）；13h（b）；39.5h（c）. 培养70h（d），将 细胞球分离成单细胞再种植于滋养细胞层（空箭头），有典型的神经元样 长突起细胞形成（黑箭头）。
a c
b d
人骨髓源性神经干细胞。张某，女，42岁d. 骨髓基质细胞 原代培养 8 天（a,b），细胞发育更大、更圆，颗粒明显。 培养 10天d (c,d)，具有长突起的神经元样细胞分化形成，突起间有连接。
a
b
人骨髓源性神经干细胞。 朱某，男，27岁。分化前 的干细胞阶段（a, 12天） 及分化后形成典型的神经 元样长突起细胞(b，20-30 天 )。
假伤组14×24h脑片(未见BrdU+细 胞, × 400)
模型常规治疗组14×24h 脑 片(偶见BrdU+细胞, × 400)
关于移植后NSC 出现时间的初步探索（家犬）
干细胞经脑室治疗组：伤后第 14×24h伤区BrdU+细胞，× 400
干细胞经血管内治疗组：伤后 第14×24h中脑伤区BrdU+细胞, × 400
U251细胞接种裸鼠两个月，于接 种部位可见明显的肿瘤组织形成
骨髓源性NSCs接种裸鼠四个月后，接 种部位未见有异常组织形成，表明体外 培养的骨髓源性NSCs不具有体内成瘤 性。
四、骨髓源神经干细胞的活体示踪
神经干细胞的标记示踪
图1 光镜下显示菲立磁（Feridex）标记后的 大鼠骨髓源性神经干细胞（培养1周）的典 型Prussian Blue染色（可见细胞浆内许多细 小的蓝色铁颗粒）
a
b
c
e
d
a 造模后10w, 对模型动物进行灌注． bcd：恒河猴大脑．
e：恒河猴脑干
再固定后冰冻切片
双侧黑质中线两侧DAB染色对比. 左图为正常侧，右图为模型侧 （造模后10w, 40×)
对照侧
模型侧
中脑切片DAB染色显示双侧红核（造模后10w, 40×）
a
b
a 恒河猴中脑切片对照侧黑质TH染色, 改良SABC法 （造模后10w, 200×,） b 恒河猴PD模型侧TH染色，改良SABC法 （造模后10w, 200×）
（No TH-gene）
BHK Control
(With THgene)
BHK Anti-TH
(With TH-gene)
BHK-th
BHK-th
转TH基因免疫细胞化学检测 （为NSC转基因移植治疗奠定基础）
体外Brdu标记阳性的恒河猴骨髓源性神经干细胞 (10d, 200×)
a
b
c
d
e
f
源于人骨髓基质细胞的神经干细胞，移植前以rAAV-GFP 标记的细胞状态
Lif因子培养10天纯骨髓源性神经干细胞
纯培养基空白对照
肝脏细胞阴性对照
20%
30%
a
b d 10%
40%
c
源于人骨髓基质细胞的神经干细胞，移植前状态。
骨髓源性神经干细胞移植手术中。 (神经干细胞准备)
手术显微镜检测下进行神经干细胞移植。
术前
术后（6个月）
伤后３个月运动性失语神经干细胞移植术
术前
术后（4个月）
C3-6损伤3个月病员，神经干细胞移植术
三、骨髓源神经干细胞致瘤性研究
神经干细胞的致瘤性研究
U251细胞豆球蛋白A（ConA）凝集试 验（ConA:100μg/ml），显示U251肿 瘤细胞有明显的凝集反应，细胞表面 结构发生改变。光镜100×
骨髓源性NSC豆球蛋白A（ConA） 凝集试验（ConA:100μg/ml），显 示骨髓源性NSC无明显的凝集反应。 光镜200×
c
a
b
源于人骨髓神经干细胞的长突起细胞免疫细胞化学方法鉴定。
a NSE阳性. 双极神经元. b GFAP-阳性，神经胶质细胞。.
天冬氨酸
氨基酸标准品混合液 4.183: 天冬氨酸； 7.947: 谷氨酸； 11.661:甘氨酸
RA因子培养10天纯骨髓源性神经干细胞
谷氨酸
氨基酸标准品混合液 4.183: 天冬氨酸； 7.947: 谷氨酸； 11.661:甘氨酸
a
b
c
d
人骨髓源性神经干细胞。李某，男，45岁. 由源于骨髓基质细胞的神经干细胞球分化出神经元样长突起细胞。 14d （a、b），17d（c、d）.
a
b
人骨髓源性神经干细胞。何某，女性，22岁. 源于骨髓基质细胞的神经干细胞克隆球及其分化的神经元样长 突起细胞。 原代培养12d（a ） ， 18d（b ）。
b
c 分化后细胞光镜下的形态（24d，100×）
c
a
b
c
d
恒河猴骨髓源性神经干细胞分化为典型的神经元样细胞
a b
恒河猴骨髓源性NSCs。 a Nestin染色 （10天，DAB显色，200×） b 分化后表达NSE抗原阳性的细胞 （ 20天， DAB显色，200×） c 分化后表达GFAP抗原阳性的细胞 （ 18天，DAB 显色，200×）
家犬骨髓源性神经干细胞经BrdU+标记后移植至损伤脑内（×400 ）
关于NSC移植途径的初步探索（家犬）
a
b
c
d
人骨髓源性神经干细胞。陈某，男，38岁. 神经干细胞克隆球形成，并有长突起细胞分化。
a: 0h c:10d
b: 7d d:12d
人骨髓源性神经干细胞增殖分裂情况（１）
人骨髓源性神经干细胞增殖分裂情况（２）
骨髓（室管膜、脂肪）
诱导分化 传代增殖
神经干细胞
移
植
优点 ①骨髓来源丰富、获 取容易 ②不存在伦理问题 ③不存在免疫排斥问题 困难 定向诱导分化难度大
4.髓鞘移植
获取胚胎嗅鞘细胞
培养传代增殖
髓鞘细胞
移
植
存在问题 ①仅适用脱髓鞘疾病 ②伦理问题 ③免疫排斥 ④细胞数量少
二、骨髓源神经干细胞的横向分化
pWAV2
Amp r
polyA ITR
CoiE1
SV40 Neomycin EcoR I
SP6
EcoR I
CMV ITR
Kpn I TH EcoR I Sma I Sal I Bgl II
pWAV2 -TH
Ampr
polyA ITR
TH基因载体构建
Control
（No THgene）
Anti-TH
家犬骨髓源性神经干细胞分化而来典型的神经元样细胞。 （ × 400 ）
家犬骨髓源性神经干细胞。扩增72h，克隆形成 （ × 200）
恒河猴的捕捉、麻醉、骨髓 获取。
a
恒河猴骨髓源性NSCs。 a 纯化后MSCs光镜下 形态（1d, 200 ×） b 增殖后形成的岛屿状细胞团（7d, 200×）
离心，细 胞悬浮于 0.85% 生 理盐水中
动物切片
人PET等
动物/人神经干细胞
a
b
a 原代培养24h。 Nestin 阳性的细胞克隆形成（箭头） b 传代培养48h。 细胞再次形成克隆（箭头）
a a b
b 形成的神经干细胞克隆球 有神经元/神经胶质细胞样长突起细胞分化
图1. 在苏木素预染背景下由神经球传代培养后的Nestin阳性细胞（↑）。而已分化的细胞则呈Nestin阳性（▲）(400X) 图2. 在有血清条件下传代培养3周的NSE阳性细胞 (400X) 图3. 在有血清条件下传代培养3周的GFAP阳性细胞 (400X) 图4. 在无血清传代培养中的Nestin阳性神经球(400X)
三种实验材料
雌性SD大鼠
雄 性 大 鼠
阴道脱落细胞涂片 排卵期
合笼
0.5天胚鼠（精子+）
（2） 大鼠、猫、家犬骨髓 （1） 10.5-14.5日胚鼠（作对照）
（ 3）
恒河猴 / 成人骨髓
骨髓穿刺
主要移植过程
动物神经干细胞
BrdU或GPF标记）
观察 经立体定向或 静脉或脑室注 射，移植到模 型动物或病员 体内