3 甲壳素分解代谢过程中涉及的相关酶
3. 1 甲壳素酶 甲壳素酶( Chit inase) 又称几丁质酶, 广泛分布
于细菌、真菌、放线菌等微生物体内, 植物的茎、叶、 种子及愈伤组织以及动物的消化液、腺体、胃和肠
粘膜等部位。甲壳素酶的分类及作用机制如表 1。
表 1 甲壳素酶的分类及作用机制
名称
甲壳素 内切酶
中国食品添加剂
China Food Addit ives
2004 No 1
甲壳素研究和应用
郎亚军 张苓花 王运吉
( 大连轻工业学院生物与食品工程系, 大连 116034)
摘要: 本文简要介绍了甲壳素和壳聚糖的结 构、理化性质及制备方法, 重点对酶法生产甲壳素涉及 的酶及甲 壳素酶的基因工程进行了综述, 最后对甲壳素及 壳聚糖的应用与发展作以展望。
前言
甲壳素( chitin) 又名几丁质, 是 自然界中含量 仅次于纤维素的一种多糖, 同时, 也是地球上数量 最大的含氮有机化合物。其在自然界中主要存在 于节肢动物( 主要是甲壳纲如虾、蟹等, 含甲壳素高 达 58~ 85% ) 、软体动物、环节动物、原生动物、腔 肠动物、海藻及真菌等中, 另外在动物的关节、蹄、 足的坚硬部分, 动物肌肉与骨结合处, 以及低等植 物中均发现有甲壳素的存在。
在研究鳕鱼( Gadus morhua) 几丁质酶时, 发现几丁 质酶的分泌与季节有关, 这与食物的季节变化不无 关系[ 17] 。 3. 2 壳聚糖酶
壳聚糖酶( chitosanase) 和甲壳素酶同属于专一 性酶类, 催化水解壳聚糖中的氨基葡萄糖糖苷键。 它主要存在于真菌和细菌细胞中, 在单子叶和双子 叶植物中也发现有该酶的活性[ 20] 。
由于甲壳素分子量很大, 水溶性差, 在人体内 不易被吸收。而壳聚糖及其衍生物是其经过降解 生成的一类低聚物, 溶解度较高, 所以表现的生物 活性也就更加明显。
酶解法又称为生物降解法, 即用专一性或非专一 性酶对甲壳素进行降解, 制得甲壳低聚糖。与其他三 种方法相比较, 采用酶解法生产具有工艺简单, 条件 温和, 无污染, 易控制降解度等优点。因而, 现在对酶 法生产甲壳低聚糖研究日益深入。相应产生的甲壳 素酶学已成为甲壳素学研究的一个重要分支。
1 结构及理化性质
1. 1 结构 甲壳素是一种天然高分子化合物, 其学名是
- ( 1 4) - 2- 乙酰氨基- 2- 脱氧- D- 葡萄糖, 是由 N- 乙酰氨基葡萄糖以 - 1, 4 糖苷键缩合而 成的。
如果把此结构式中糖基上的 N- 乙酰基大部分 去掉的话, 就成为甲壳素最为重要的衍生物壳聚糖。 1. 2 理化性质 1. 2. 1 物理性质
关键词: 甲壳素, 壳聚糖, 甲壳素酶, 微生物发酵, 基因工程
The Research and Application of Chitin
Lang Yajun, Zhang Linghua, Wang Yunji
( Biotechnology & Food Department , Dalian institude of Light Industry, Dalian 116034)
不同来源的壳聚糖酶的水解作用根据底物不 同而产生不同的产物。壳聚糖酶也可以分为两种, 即内切酶和外切酶, 作用于底物最终得到的主要是 二聚体和三聚体的降解产物和其他低聚糖。
壳聚糖酶的生产被研究较多的是将壳聚糖酶
基因克隆到链霉菌( Streptomyces lividans ) 上, 从而获 得高活性胞外壳聚糖酶[ 22] 。
提取法的工序一般为: 虾蟹壳 洗涤 晒干 脱钙 洗涤 脱蛋白 洗涤 干燥 粉碎 甲壳素 近十几年来, 以蛆皮、蚕蛹壳、蝉蜕、掸子虫、鲍 壳[ 1] 、云南琵琶甲[ 2] 、中国鲎[ 3] 、蜚蠊[ 4] 、鱿鱼骨和乌 贼骨[ 6] 为原料生产甲壳素和壳聚糖也有研究报道。 2. 1. 2 微生物法 甲壳素的生产一直以来都是采取虾蟹壳单一 原料, 采用其他原料生产的非常之少, 根据文献[ 5] 可了解我国甲壳素生产存在的问题。 甲壳素是绝大多数真菌细胞壁的主要组成成 分, 是真菌菌丝尖端延长部位的主要组分, 甲壳素的 生成与真菌菌丝的生长有密切的关系。已有的研究 主要是从柠檬酸发酵废菌丝体中提取, 另外, 也可从 青霉素、链霉素等发酵废液滤出菌丝体中提取。 近几年来, 国内已经研究和开发直接培养真菌 制取甲壳素或直接提取壳聚糖的技术。黑曲霉是 发酵工业最常用的真菌, 同时也是含有甲壳素最多 的真菌[ 8] , 通过培养黑曲霉菌来生产甲壳素和壳聚 糖, 这可能使用微生物法生产甲壳素和壳聚糖最有 前途的方法[ 7] 。由 雅致放射 毛霉( Accimonueor elegams) 及鲁氏毛霉( Mucor rouxianus ) [ 25] 等丝状真菌 生产甲壳素及壳聚糖近几年也有诸多研究。 2. 2 壳聚糖制备方法 2. 2. 1 微波法 84
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也会缓慢水解, 溶液的粘度逐渐降低。 1. 2. 2 化学性质
甲壳素和壳聚糖化学性质的研究, 内容十分广 泛, 其分子结构当中含有羟基、氨基和自由基, 可以 发生酰化、酯化、醚化、氧化、烷基化、螯合、接枝共聚 及交联等一系列化学反应, 这对于研究认识它们的 本质, 进行创新性工作, 开发新产品有重要意义。
( Aspergilus oryzae ) 木霉
( Trichioderma harzianum) 淡紫拟青霉
( Paecilomyces lilacinus)

灰色链霉菌
( Streptomyces plicatus ) 红色链霉菌
( Streptomyces olivaceoviridis ) 铅青链霉菌 ( strep lividans ) 其它一些未定 种的链霉菌
Abstract: The article briefly introduced the structure, property and preparation of chitin and chitosan, and summarized the chitinase and the gene engeering of the chitinase. In the last, pointed out the research development of chitin and chitosan. Key words: Chitin, Chitosan, Chitinase, M icroorganism fermentation, Gene engineering
[ 13]
近年来, 对来源于植物和微生物的甲壳素酶的
分子量、等电点、Km 等酶学性 质以及影响酶 活性
的温度、pH、金属离子、离子强度等因素已进行了
大量的研究。目前, 动物来源的甲壳素酶的研究尚
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较薄弱。产生甲壳素酶的微生物如表 2 所示。参 考文献[ 16, 18, 26] 。
2 制备方法
2. 1 甲壳素制备方法 甲壳素的生 产一般采取以虾、蟹为 原材料脱
钙、脱蛋白和脱乙酰的传统基本工艺, 耗碱量极大 且污染严重。随着研究的深入, 为了解决原材料单 一, 污染严重等一系列问题, 又发展了微生物法、微 波法和生物制备法等来生产甲壳素和壳聚糖及他 们的衍生物。 2. 1. 1 提取法
表 2 甲壳素酶的微生物来源
细菌
真菌
放线菌
粘质沙雷氏菌 ( serratia marcescens ) 环状芽孢杆菌
( Bacillus circul ans) 地衣芽孢杆菌
( Bacillus lichenif ormi s) 斯氏假单孢菌
( Pseudomonas strutreri ) 巨大芽孢杆菌
壳聚糖是甲壳素脱去大部分乙酰基后的产物, 是甲壳素最为重要的衍生物。自从 1811 年, 法国 科学家 H. Braconnnot 发现甲壳素以来, 甲壳素逐渐 被认识与利用。近年来, 国内外相关的研究日趋活 跃, 甲壳素和壳聚糖已被现代科学称之为继糖、蛋 白质、脂肪、维生素、矿物质等五大生命要素之后的 第六生命要素。甲壳素和壳聚糖经过改性之后生 成的改性高分子具有无毒、可以完全被生物降解、 在自然界形成良性循环等诸多优点, 显示了良好的 应用前景。
3. 3 非专一性酶类 许多非专一性的酶对甲壳素及壳聚糖也有水
解作用。迄今为止, 已经发现有 30 多种酶对甲壳 素及壳聚糖有非专一性的降解作用。这些酶主要 来源于动物、植物和微生物, 包括糖酶、蛋白酶、脂
肪酶等。 在此类酶中, 比较重要的有纤维素酶、溶菌酶、
脂肪酶、甲壳素脱乙酰基酶、壳聚糖脱乙酰基酶、木 瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等。近年来, 对甲壳素及壳 聚糖的非专一性酶类的研究较多, 且非专一性酶类 比甲壳素酶经济上便宜得多, 所以非专一性酶类的 研究及使用具有广阔的前景。
非专一性酶类对甲壳素和壳聚糖也有较好的 降解作用, 各种酶的降解机理并不完全相同, 但是 几种非专一性酶混合使用降解效果却好于单一的 非专一性酶的作用。
4 甲壳素酶的基因工程
来源于植物和微生物的甲壳素酶一直是研究 的热点。迄今为止, 已经克隆出许多源自细菌、真 菌、植物的甲壳素酶基因, 成功的构建了大肠杆菌、 链霉菌以及酵母菌等许多工程菌。粘质沙雷氏菌 ( Serratia marcescens ) 是 研究最 为热门 的微 生物 之 一[ 13] 。同时, 采用基因工程, 把外源植物的甲壳素 酶的基因进行克隆, 构建转基因植物, 提高植物抗 性的研究也日益深入。到目前为止, 已对烟草、马 铃薯、油菜、甜菜、胡 萝卜、豌豆、菜豆、黄瓜、拟南 芥、花生、水稻、大麦、杨树等植物的几丁质酶基因 进行了 cDNA 克隆和序列分析[ 19, 23, 27] 。