RNA酶的蛋白抑制剂(RNAsin)等。
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（1）提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备
• 塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用0.1％ DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具 因可被氯仿腐蚀，故不能使用氯仿处理）。
• 玻璃用品：使用前于180℃的高温下干烤6h以上， 或在220℃下干烤3h以上。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇沉淀即可使核酸分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入
冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
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基因组DNA－SDS法
SDS法原理
基因组DNA不复性与蛋白质形成絮状沉淀。 • 离心后，质粒DNA留在上清液中。
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煮沸裂解法（偶尔用）
• 通过加热，使细菌裂解、蛋白质和DNA变性。 • 降低温度，质粒DNA复性留于上清液，基因组DNA复性很慢
与蛋白质形成沉淀，可通过离心除去。
梯度离心法（极少用）
• 基因组DNA断裂，吸附大量EB，密度大；质粒DNA密度小。 • 利用氯化铯梯度离心，分离基因组DNA和质粒DNA。
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4、质粒DNA的纯化
• 离心分离后，吸取含有质粒DNA的上清液。 • 用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。 • 用乙醇或异戊醇沉淀质粒DNA（与基因组DNA方法同）。
核酸溶液 蛋白质
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苯酚氯仿
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四、RNA的提取
（一）总RNA的提取
所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：
①样品细胞或组织的有效破碎；
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5、试剂盒快速提取法
• 裂解液含胍盐，抑制RNA酶，使蛋白质和DNA同时 变性；
• 氯仿等抽提去除蛋白质和DNA； • 乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA； • 此法操作简便快速。
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Trizol一步提取总RNA：
TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂， 可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白， 核酸物质解聚得到释放。 苯酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制 RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、β巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
rRNA、5s rRNA的三条带，其中28s rRNA的亮度
应为18s rRNA的两倍，5. s rRNA 较弱。
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六、电泳
根据电泳支持介质分为
琼脂糖凝胶电泳： 多用于鉴定较大核酸片段（0.1~60 kb） 聚丙烯酰胺凝胶电泳： 用于鉴定较小的核酸片段（50~1000 bp）
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琼脂糖凝胶电泳
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3、微生物培养物样品
离心获取菌体细胞， 加缓冲液洗涤， 加缓冲液悬浮菌体细胞。
4、微生物混合样品
用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。 高速离心获取菌体细胞。 用缓冲液洗涤菌体细胞。 加缓冲液悬浮菌体细胞。
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（二）提取用具预处理
1、DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无 DNA酶处理。
苯酚氯仿
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3.沉淀DNA
有机溶剂沉淀DNA：2倍体积无水乙醇（或1倍体积的异戊醇）
再用75%乙醇清洗多次。
4.重新溶解DNA
将DNA溶于水或TE溶液。
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基因组DNA－CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷 基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 并与核酸形成复合物。
6）取上清0. 5ml（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也 不要吸到中间层的物质）放入另一个1.5ml的EP管中；
7）加入等体积的异丙醇（0.5ml），涡旋混匀；
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8）室温，静置10分钟（该条件由Trizol试剂盒提供；其他提供的
条件用-20℃、1小时，目的为了更好分层）
9）离心机4℃、14000转/分，离心10分钟
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2、收获细菌和溶菌
• 离心收集细菌细胞。
• 细菌裂解方法： 机械法 化学试剂法 （SDS） 溶菌酶－化学试剂联合法（最常用）
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3、分离质粒DNA 基因组DNA与质粒DNA分离
碱裂解法（最常用）
• 用溶液1（EDTA）悬浮菌体。 • 溶液2（NaOH和SDS）裂解菌体，蛋白质与DNA发生变性。 • 溶液3中和pH，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下 能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋 白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉 淀水相中的DNA。
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DNA提取的一般流程
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4、一步快速热酚抽提法
• 将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂SDS等联合使 用，抑制RNA的降解，裂离；
• 用高温苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙 醇或异丙醇沉淀纯化RNA。
• 此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品， 对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。
真空干燥5分钟）
14）加入50μl DEPC处理水溶解（可以根据管底的白色沉淀判断
RNA量的多少加DEPC处理水）
15）-80℃冰箱保存。
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组织匀浆
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（二）mRNA的提取
从总RNA中分离mRNA， 用Oligo（dT）层析柱。 mRNA含polyA，在高盐浓度条
件下与Oligo（dT）结合，其 他成分被洗掉，再用低盐浓 度洗脱mRNA。
• 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水 冲洗，乙醇干燥，再用3％H2O2室温浸泡10min，然 后用0.1％DEPC水冲洗，晾干。
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• 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA 提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药 匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
• 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃ 处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高 压灭菌15分钟，去除残余DEPC。
2、RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase无处不在且 耐高温，提取条件要求严格。
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二、真核生物基因组DNA的常规提取
裂解细胞，溶出DNA
除去杂质
沉淀、浓缩DNA
重新溶解DNA
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⒈ 破碎细胞，溶解DNA：
用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。
微生物样品提取液：含表面活性剂SDS、溶菌酶等 动物样品提取液：含SDS、蛋白酶K等 植物样品提取液：含CTAB
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五、核酸的鉴定
（一）核酸浓度检测
OD260＝1时（比色皿厚度1.0cm） 双链DNA浓度为50 μg/ml， 单链DNA或RNA浓度为40 μg/ml。
DNA(μg/ml) = OD260×50 RNA（μg/ml ） = OD260×40
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（二）核酸纯度检测（紫外吸收法）
• 核酸在260 nm处有吸收峰，蛋白质在280 nm有吸 收峰
10）弃上液(移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，沿
液面吸弃约0.9ml上清；第2步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接触 到沉淀斑区）
11)沿试管内壁轻轻加入1ml 4℃预冷的75%乙醇,注意切勿 冲击到沉淀斑区
12）离心机4℃、10000转/分，离心5分钟
13）弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过 程中把RNA烤干），60℃恒温箱干燥5分钟（注意：打开管盖；或用
核酸酶可被Ca2+、Mg2+等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTA， 柠檬酸等），螯合这些离子。
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10
2、除去杂质（主要是蛋白质）
（SDS，破膜、蛋白质变性沉淀）——苯酚抽 提蛋白质——氯仿抽提、萃取苯酚
经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、 中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯 仿溶液。
核酸溶液 蛋白质
第七章 核酸提取与鉴定
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核酸的提1取与鉴定
概述
第一节 预处理
第二节 DNA的提取
第三节 RNA的提取
第四节 核酸的鉴定
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2
一、概 述
研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA
过程：
裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离 在裂解体系中
纯化：使核酸与其它杂质彻底分离， 如蛋白质、盐等
总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；
• 这种方法能得到高质量的RNA，同时分离出细胞 染色体DNA。
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2、盐酸胍-有机溶剂法
• 利用盐酸胍使蛋白质变性，抑制RNA酶；
3、氯化锂-尿素法
• 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶； • 氯化锂选择性沉淀RNA。 • 其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA
会丢失一些小分子RNA。
< 1.8，含蛋白杂质；>. 2.0，RNA出现降解
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（三）核酸完整性检测
• 电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。
• 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电 泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳）， 溴化乙锭染色，紫外灯观察。
• 凝胶上RNA存在处可观察到清晰的条带。完整性