离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理
离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的SDS-碱裂 解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗 液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的 洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
质粒DNA提取及检测——实验准备
洗脱液 EB
10 μg/ml RNase A 10 mM Tris-HCl （pH 8.0）
1 mM EDTA （pH 8.0 ）
质粒DNA提取——实验流程
对数期菌体
上清液
溶液I充分重悬 溶液II裂解
离心
过柱 离心洗涤
质粒DNA溶液
溶液III中和
干燥溶解
详细实验步骤请参考说明书！
质粒DNA提取——电泳检测
RNase非常稳定，它 在一些极端的条件可 以暂时失活，但限制 因素去除后有迅速复 性。用常规的高温高 压蒸气灭菌方法和蛋 白抑制剂都不能使 RNase完全失活。
总RNA提取——去除RNase污染
玻璃器皿处理： 量筒、试剂瓶等玻璃器皿须200℃烘烤2小时以上。
塑料器皿处理： 0.1%DEPC水溶液浸泡过夜，再高温高压灭菌。
DNA中残留有金属离子 ——重新70%乙醇漂洗
基因组DNA提取常见问题分析
DNA降解
材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA
被机械打断 外源核酸酶污染
基因组DNA提取常见问题分析
DNA提取量少
实验材料不佳或量少 —— 选取新鲜（幼嫩）材料
质粒类型
• 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进 行的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个 细胞中只有一份或几份拷贝；
• 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下 进行的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的 药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至 几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要 经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。
基因组DNA提取常见问题
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应 DNA降解 DNA量少
基因组DNA提取常见问题分析
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质 ——抽提纯化、高盐洗涤
DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 ——重新沉淀
一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取
基因组DNA提取方法
基因组DNA提取的几种常用方法： CTAB法 SDS法 其他方法
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六 烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解 细胞膜，并与核酸形成复合物。
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl （ pH 8.0）
EDTA （ pH 8.0）
NaCl
CTAB
PVP40 β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
0.4 M
3% (W/V)
5% (W/V)
2%（V/V）使 用前加入
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形
总RNA提取及检测——实验准备
1.实验器材
台式高速冷冻离心机、移液器、定时器、 marker笔、酒精喷壶、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、紫外分光光度计、
微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。
2.实验耗材
1.5 mL EP管（RNase free）、各规格Tip （RNase free） 、 一次性手套、一次性口罩等。
试剂处理： 氯仿、异丙醇、无水乙醇新开后RNA专用。0.1%DEPC水 配制75%的酒精。
专用的RNA操作室、专用器械。
操作时戴口罩、手套、帽子、穿实验服。
总RNA提取——样本准备
植物/动物组织样本： 新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或-80℃。 为避免反复冻融，需小份分装（50~100 mg/份）。
293细胞总RNA
带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解 （因为大的RNA被酶降解的可能更大）。
总RNA提取——产量产率与纯度检测
1.打开紫外分光光度计设定参数，具体操作参照 仪器说明。
2.取少量待测RNA样品，用TE Buffer稀释50倍（ 或100倍）。
3.用TE Buffer做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。
4.实验材料
对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5α）
质粒DNA提取——碱裂解法
碱裂解法试剂配方
Ⅰ液 Ⅱ液 Ⅲ液
组分1 25 mM Tris-HCl （pH 8.0）
组分2 10 mM EDTA（pH 8.0 ）
0.2 M NaOH
1% SDS
3 M KAc （pH 4.2）
RNase A
质粒DNA提取常见问题分析
RNA残留
忘记加RNase A？ I液中RNase A失效？ 酶量不够？
质粒DNA提取常见问题分析
质粒断裂
II 液裂解时间过长？ 裂解时动作过于剧烈？
质粒DNA提取常见问题分析
量少
凝胶是否有问题？ 菌体量少 菌体重悬不彻底 裂解不完全 菌株老化 严谨型质粒
成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中 酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB法实验流程
植物材料
抽提
离心洗涤
液氮研磨
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
核酸沉淀
DNA溶液
基因组DNA提取——SDS法
SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞 ，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
DNA主要储存遗传信息。 RNA主要传递遗传信息。
核酸简介
如何分离DNA？ 如何分离RNA？
核酸简介——质粒DNA
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小 从1-200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋 状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具 有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝 数，并表达所携带的遗传信息。
组份 终浓度
Tris-HCl （pH 8.0）
50 mM
EDTA （pH 8.0 ）
20 mM
NaCl 0.4 M
SDS 2%
Tris-HCl（pH8.0）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破
坏；
EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl：提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中
。基因组DNA提取——S来自S法 SDS法实验流程（以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
液氮研磨 或匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖凝胶电泳：
以琼脂糖凝胶作为 支持物，利用DNA分子 在泳动时的电荷效应和 分子筛效应，达到分离 混合物的目的。
小鼠gDNA电泳图
该复合物在高盐溶液中（>0.7 mol/L NaCl）是可溶的 ，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质 后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH 8.0）
EDTA （pH 8.0 ）
100 mM
琼脂糖凝胶电泳检测
质粒DNA的三种带型：
1.共价闭合环状DNA分子：质粒 双链没有断裂；超螺旋结构；泳 动速度最快； 2.半开环质粒DNA分子：质粒的 一条链断裂；松弛的环状分子； 泳动速度最慢； 3.线性DNA分子：质粒的两条链 均断裂；泳动速度居中。
质粒DNA提取常见问题 RNA残留 质粒断裂 量少
3.实验试剂
TRIzol 总RNA提取试剂（YRBIO) 、氯仿、异丙醇、75%乙醇 （RNase free）、DEPC H2O （RNase free） 等。
4.实验材料
新鲜293细胞
RNase是导致RNA降解的最主要物质！ RNase的来源
样品 试剂 多次使用的器具 裸露的手 说话产生的唾沫 空气
破壁或裂解不充分 ——充分研磨、破壁酶、延长裂解时间
沉淀不完全 ——低温、延长沉淀时间
洗涤使得丢失DNA
一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取 五．琼脂糖凝胶电泳
质粒DNA提取
质粒DNA提取的方法： 碱裂解法 煮沸法
质粒DNA提取——碱裂解法原理
TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中 异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与 蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它 可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离 心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中 的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主 要为DNA和蛋白质。
20 mM
NaCl CTAB β-巯基乙醇
0.4 M
2% (W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。