梯度洗脱
A A泵
进样器
色谱柱 柱温箱
B 浓度 B
B泵 时间
检测器
MeOH
梯度洗脱
95%
30%
优点：可提高分离度、缩短分离时间、 降低最小检测量和提高分离精度。
二、进样系统
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置：
三、分离系统
色谱柱：
C18色谱柱
SIL XDB-C8
填料：
十八烷基硅基化学键合 到多孔硅胶或陶瓷微粒
多孔硅胶微粒
辛基硅烷化学键合到 多孔硅胶微粒上
化学键合固定相:
目前应用最广、性能最佳的固定相。
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
四、检测系统
1、紫外检测器
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
ci i%
mi
m1 i m2 ii
mn
100%
ii
Ai
n
100%
Ai
i1
fi 称为校正因子。 fi ＝0？
同一检测器，对不同组分的敏感度不同。
校正因子fi 分为绝对和相对校正因子两种。 绝对校正因子：
fi
Wi Ai
由于受到仪器及操作条件的影响程度很大， 实际定量分析时，基本上不使用。
相对校正因子 fi ： 某物质 i 与一选择的标准物
流动相：酸性或碱性水溶液； 基本原理：利用不同离子对树脂的 离子交换能力不同来实现分离。 应用：离子及可离解的化合物，
氨基酸、核酸等。
4)排阻色谱（又称凝胶色谱）
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ按分子大小分离。 小分子可以扩散到凝胶空隙，由 其中通过，出峰最慢；中等分子 只能通过部分凝胶空隙，中速通 过；而大分子被排斥在外，出峰 最快。
可对相对分子质量在100-105 范围内的化合物按质量分离。
2、按极性分类:
1) 正相色谱：
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动 相所组成的色谱体系。其代表性的固定相是改性硅 胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。
2) 反相色谱：
由非极性固定相和极性流动相所组成的色谱 体系，与正相色谱体系正好相反。其代表性的固定 相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相 是甲醇和乙腈。是当今HPLC最主要的分离模式。
2)分配色谱（液-液）
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 固定相：由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体 表面涂渍固定液，固定液易流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶（担体）表面。C-18柱:
3)离子交换色谱
固定相：阴离子离子交换树脂 或阳离子离子交换树脂；
第二节 高效液相色谱仪的组成
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
一、输液系统
高压输液泵 脱气装置 梯度淋洗系统
1、高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。μL/min~几千mL/min 应具有压力平稳、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
4、质谱检测器
第三节 高效液相色谱法的应用
一、定性分析
(1) 保留值定性 (2) 相对保留值定性 (3) 与其他仪器联用
标准品：A-甲醇；B-乙醇；C-正丙醇； D-正丁醇；E-正戊醇
二、定量分析方法： 1、校正因子定量：
组分的峰面积越大, 在样品中所占比例越大?
W = f A W = f A ?
HPL C
t ：1 h
高压、高效、高速
二、高效液相色谱法的分类
1、按分离原理分类
吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱
2、按极性分类
正相色谱 反相色谱
1、按分离原理分类 1)吸附色谱（液-固）
固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常 使用的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相上的吸附与解吸。 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样。
质 S 的 绝对校正因子之比:
f
' i
fi fs
Wi Ws
/ /
Ai As
相对校正因子只与检测器类型有关，而与色谱条 件无关。
常用于作为标准物质S的有苯（热导检测器） 和庚烷（氢火焰离子化检测器）等。
选择的标准物质S一起加入试样中—— 内标法：
2、内标法 —— 标准物质在未知样内部
准确称取一定量的未知样Wi，加入已准确定量的内标物WS。
2、脱气装置
用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱 气装置再输送到色谱柱。
脱气机、超声脱气、真空脱气等。
3、梯度淋洗装置
等度洗脱
输液泵 进样器
柱温箱 色谱柱
检测器
单一或混合溶剂
等度洗脱
MeOH / H2O = 6 / 4 分析时间长
分离度差
MeOH / H2O = 8 / 2
怎样解决呢？
高效液相色谱法与经典液相色谱法
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
经典液相 色谱法
高效液相色谱仪
经典液相色谱
HPLC
固定相粒径
150-200 μm
3-10 μm
流动相驱动方式 重力或低压泵
高压泵
流动相流速
很慢
快(1-10mL/min)
柱长：170 cm 柱径：0. 9 cm F：30 mL/h t : >20 h
fi'
fi fs
Wi Ws
/ /
Ai As
Wi
fi' Ws
Ai AS
s
Standard
i Sample
高效液相色谱仪的原 理及应用
高效液相色谱 high performance liquid chromatograph，
HPLC
Agilent 1100
第一节 高效液相色谱法的原理
一、高效液相色谱法的特点
气相色谱法：较易挥发、且热稳定的有机化 合物。～20%
液相色谱法：用气相色谱法难以分析的物质， 如难挥发、热不稳定、分子量大、具有生物 活性的物质。～80%
UV 灯
滤光片
采样二极管
光栅
狭缝 镜1
样品池
镜2 参考二极管
2、光电二极管阵列检测器 DAD
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。
3、荧光检测器
高灵敏度、高选择性； 对 多 环 芳 烃 、 维 生 素 B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应。