滴定分析（原料药、制剂定量分析）
紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析）
薄层色谱（鉴别、有关物质检查等；半定量分析）
HPLC（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的 检查；复杂样品定量分析等）
什么情况下使用HPLC？
1、对分析结果、测定速度和效率的要求 准确度要求：准确定量（RSD<5％）
测定速度和效率：快速，单一或多组分测定。
S
N
常用液相色谱的检测器
常规检测器
示差折光检测器（Refractive Index）
紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） 荧光检测器（Fluorescence） 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） 其他检测器（Other Detectors）
高端检测器
光电二极管矩阵检测器（Photodiode Array PDA） 质谱检测器（Mass Spectrometry）
查阅有关的文献资料
文献资料——无：
结合样品的情况，首先应作一些试探性的工 作。 （见后面）
评价高效液相色谱方法的标准
只有更好，没有最好！
问题：什么样的分离结果是好的？ 答：用尽可能少的时间和消耗（人力、物力、财 力等）满足分析的要求（准确度、灵敏度、分析 速度等）。
评价液相色谱方法的标准
理论塔板数n ：分离效率（柱效）的量度
2、样品情况 样品的复杂情况：HPLC适用于复杂样品的分析， 如中药分析、环境分析、体内药
物分析、临床药物分析等。
HPLC方法建立的前期工作
样品情况的了解：
样品的种类（来源）：植物（中草药）、合成中 间体、生物样品（血液、尿液、组织匀浆等） …… 样品的种类决定了样品的复杂程度（基质影响） ，从而可初步判定测定的难易程度并且为分析方 法的确立设计一个大致的方向。
1906年正式命名
色谱法；Chromatography
30年代开始广泛研究和应用
主要是气相色谱及薄层色谱
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科学家
M. S. Tswett
正式命名“色谱”的文献中的一段话
什么情况下使用HPLC？
一般情况下HPLC不是分析方法的首选 分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）：
样品情况的了解：
测定成分的数量以及性质相似程度：
单一成分的测定，最简单，随着测定成分的增 加，分析的难度增加；
组分性质的相似程度越高，分析的难度越高。
问题：组分性质的相差越大，分析的难度越低，是否 越有利于多组分分析？
查阅有关的文献资料
文献资料——有：
在文献的基础上，调整、改善。
不排除在文献基础上全面创新。
背景吸收的影响
吸光度
理想
2
1
实际
1
0
背景吸收降低 了线性范围
背景吸收
0
多数流动相有 背景紫外吸收
浓度
荧光（Fluorescence）检测器
发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到 激发态，其返回到基态时发射光的现象即荧光。
1. 分子在吸收UV或可见光后进入激发态，分子达到 不稳定的高能量状态。 2. 电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的 激发单重态。 3. 电子失去能量达到基态时发出荧光 共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象
文献资料查询——无
根据评价液相色谱方法的标准，结合样品的情 况，作一些试探性的工作
一、根据了解的样品信息以及分析目的， 建立样品预处理方案
色谱分析样品预处理的主要目的
将待测物质有效地从样品基质中释放出来，制成便于 分析测定的稳定液体试样。如：中草药或中成药有效 （指标）成分分析；体液中药物或代谢物含量的测定 等。
激发态
S1 振动能（2）
基态
激发 （ 1）
S0
发射 （ 3）
荧光检测器原理
荧光检测器的应用
环境中的污染物 多环芳烃(PAH)，多 酚，氨基甲酸酯等 食品、饮料 食品中的毒素；例 如：黄曲霉毒素 染料 维生素及衍生氨基 酸 生物技术及制药
多环芳烃（PAH）
O O
O
O O CH3 O
黄曲霉毒素
H3C CH3 CH3 CH3
UV/Vis检测器
目前实验室中最流行的选择 约75%的HPLC检测器配备的是UV/Vis（其中50% 是可变波长，25%是PDA） 吸光度与样品浓度呈线性关系
在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
UV/Vis的 优点
简单、可靠 多数人熟悉并喜欢这种技术
可以作梯度实验并且是非破坏性的
大多数有机化合物有一定程度的吸光度
任何先进的色谱技术都须有先进的样品处理技术相匹 配，样品处理技术的适当与否，直接关系到色谱分析 的成本、速度和实用性。
样品预处理的种类
物理的分离与浓缩技术 过滤、沉淀分离、吸附、蒸馏、溶剂的挥发 溶剂萃取 回流、索氏提取、超声波提取
固相萃取（SPE）
吸附剂（硅胶、氧化铝）、高分子大孔树脂（ 苯乙烯－二乙烯苯）、离子交换树脂、 键合硅胶等 超临界流体萃取 化学衍生化技术
tR1 tR2 分离度的公式：
R
t R 2 t R1 1 ( W 2 W1 ) 2
R：分离程度的量度 简称分离度
影响分离度的因素：k、α及n
分离度方程：
k 2 1 n R k 1 4 2
是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之 间作用的强弱
文献查阅时应注意的基本内容
液相色谱实验所需的基本参数 样品预处理方案 对照品（标准品）的配制方法 流动相：种类及配比，等度或梯度？ 固定相：色谱柱类型、颗粒大小及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器及相应参数：如紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称 色谱分析条件。
选择液相色谱的检测器要考虑的因素：
你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等
流动相的影响
溶剂、缓冲盐、改性剂等 梯度还是等度（梯度不适于整体性质检测器） 准确度要求 灵敏度需求 是否有双检测的需求
HPLC检测器的选择：
通用检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 选择性检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 RI mg 104 是 是 否 UV/Vis ng 105 否 否 否 ELSD ng 否 否 是 是 FL pg 103 否 否 否 MS pg 103 是 是 是 EC fg 106 是 是 是 MS pg 103 是 是 是
待测成分的性质：极性、水溶性、脂溶性、酸碱性 等
对方法的建立，有重要的指导意义。
样品情况的了解：意义（不是很明 显）；
对检测器的选择具有指导意义， 如：含有生色团（助色团），紫外有吸收，特别 是芳香族化合物，可考虑使用紫外检测器
待测成分的含量：
决定对柱效的要求（柱效高，可有较低的检测限） 决定对检测器灵敏度的要求
除去杂质，纯化样品，防止色谱柱的堵塞。如生物样 品中的蛋白质、叶绿素、固体微粒等。 富集浓缩样品或进行衍生化，以达到色谱分析的检测 限。
进行样品预处理的必要性
样品只有成为液体状态才能直接进行HPLC分析。 虽然色谱分析具有很强的处理复杂样品的能力，但样 品如果过于复杂（如中药饮片、中成药、生物样品分 析等），若不进行必要的预处理，则会影响到分析的 准确性，并且可能导致测定失败。
一般来说灵敏度还可以
0.15
Parabens at 254 nm
0.10 AU 0.05 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 Minutes 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00
对羟基苯甲酸酯类色谱图
UV/Vis的 缺点
由于不是所有化合物都有紫外可见吸收，因此不 是通用检测器（有时也是优点） 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要 使用多波长检测，或使用折衷的波长 受流动相组成的影响： 用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂（抑制拖尾） 也会有影响
长时间操作的稳定性
低死体积
非破坏性
选择性（可降低分析组分色谱分离的压力）
检测器的灵敏度：信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音 的比值（S/N）
6:1
检测限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 高的信噪比有利于： 更好的色谱峰确认 更准确的定量 更好地完成色谱峰纯度的确认 （较低的阈值）
1. 反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析方法的建立 2. 液相色谱常见问题及处理方法 3. 色谱联用技术（LC-MS ）
4. 制备液相色谱技术
反相高效液相色谱（RP-HPLC） 分析方法的建立
什么是色谱？
色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离方 法（工具、手段）。
除色谱之外，经典（常见）的分离方法：
HPLC的基本配置及流程
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
手动/自动 进样器 色谱泵 检测器
废液
HPLC的仪器配置
溶剂 数据处理系统 泵系统 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
色谱的发明人——茨维特（M. S. Tswett）
俄国科学家茨维特1903年利用物质的吸附原理 ，开创了应用吸附原理分离植物色素 的新方法。
理论塔板数计算公式：
tR n 16 W
2
tR n 5.54 W h/2
2
理论塔板数n ：描述组分被保留的程度以及色谱 峰谱带展宽的程度。 塔板数越大，柱效越高。
tR = 5
W = .5
W=2