业,2000,26(4):82-85.[3]Feron G,Du fosse L ,Pierard E ,et al.Production ,identification and toxicity of γ-decalactone and 4-hydroxyde -canoic acid from Sporidiobolus spp .[J ].Applied and E nvironmental Microbiology ,1996,62(8):2826-2831.[4]王建龙,施汉昌.聚乙烯醇包埋固定化微生物的研究及进展[J ].工业微生物,1998,28(2):35-39.[5]李峰,吕锡武.聚乙烯醇作为固定化细胞包埋剂的研究[J ].中国给水排水,2000,16(12):14-17.[6]牛红星,邱蔚然.用固定化啤酒酵母细胞合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱[J ].华东理工大学学报,2002,28(4):372-375.[7]W anikawa A.,H os oi K.,K ato T.C onversion of unsaturated fatty acids to precurs ors of γ-lactones by lactic acid bacteria during the production of maltwhisky[J ].Journal of the American Society of B rewing Chemists ,2000,58(2):51-56.[8]于伟,徐岩,喻晓蔚,等.生物法转化分离耦合制备γ-癸内酯[J ].化工进展,2007,26(8):1151-1154.[9]周瑾,李雪梅,吕春华,等.地霉属真菌和棒状杆菌属株协同发酵生产γ-癸内酯[J ].生物技术通讯,2003,14(1):39-41.[10]王聪,宋焕禄,吕跃钢.复合诱变选育γ-癸内酯生产菌株[J ].食品科学,2007,28(6):237-240.[11]李花子,王建龙,文湘华.聚乙烯醇-硼酸固定化方法的改进[J ].环境科学研究,2002,15(5):25-27.[12]Zhuge J.M odern Ferment M icroorganism Experimental T echnology [M ].Beijing :Chem ical Industry Press ,2005:223-225.果胶酶高产菌株EIM -4的鉴定及其液体发酵条件优化柯崇榕,田宝玉,杨欣伟,林伟铃,黄薇,黄建忠3(福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,福建福州350108)摘要:目的:通过了解高产果胶酶菌株EI M -4的背景信息及优化其最适的产酶条件,为下一步工业化生产提供依据。

方法:通过基于18S rDNA 序列的系统发育进化分析对果胶酶高产菌进行鉴定,通过单因素试验和均匀设计获得最适产酶条件。

结果:通过对18S rRNA 基因的分子系统进化分析,菌株EI M -4被鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger )。

通过单因素和均匀设计试验确定最佳产酶培养基为(g ΠL ):橘皮粉3219,黄豆粉1017,(NH 4)S O 42.1,CaC O 31.0,pH 自然。

结论:Aspergillus niger EI M -4的液体发酵产果胶酶的活力可达15159.82U Πm L 。

关键词:果胶酶;黑曲霉;分子系统进化;液体发酵;均匀设计中图分类号:Q946.5;Q93-331 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)05-0069-04Identification of A Pectinase -producing Fungi EIM -4and Its OrthogonalExperiment of Submerge Fermentation ConditionsKE Chong -rong ,T ian Bao -yu ,Y ANG X in -wei ,LI N Wei -lin ,H UANG Wei ,H UANGJian -zhong3(Engineering Research Center of Industrial M icrobiology ,M inistry of Education ,Fujian N ormal University ,Fuzhou 350108,China )Abstract :Objective :Developing available industrial technologies to produce pectinase by understanding basic in formation for a high pectinase -producing strain EI M4and optimizing its submerged fermentation conditions.Method :Identified strain EI M4by using m olecular phyloganaticanalysis of 18S rDNA sequences and im proved pectinase production by orthog onal experiment design.R esult :S train EI M -4was identified as As 2pergillus niger .Through orthog onal experiment ,the optimal submerge fermentation condition was obtained for producing extracellular pectinase.The suitable medium contained :orange peel power 32.97g ΠL ,s oybean flour 10.76g ΠL ,(NH 4)S O 42.14g ΠL ,CaC O 31.00g ΠL.,nature pH.Con 2clusion :The optimum pectinase activity of Aspergillus niger EI M -4is as high as 15159182U Πml.K ey w ords :pectinase ;Aspergillus niger ;phylogenetic analysis ;submerge fermentation ;orthog onal experiment收稿日期:2008-07-17;修回日期:2008-09-03基金项目:福建省科技厅重大项目(2005Q007)资助作者简介:柯崇榕(1984-),男,硕士生;3通讯作者:黄建忠(1966-),男,博士,教授,Email :hjz @ 。

果胶质广泛存在于高等植物中,是植物细胞胞间层和初生壁的重要组成成分。

近几年来,果胶质的生物降解日益引起国内外学者的广泛关注[1]。

果胶酶(Pectinases )是分解果胶质的一类复合酶的总称,主要通过裂解或β消去作用切断果胶质中的糖苷键致使果胶质裂解为多聚半乳糖醛酸,它广泛存在于各种细菌、真菌和放线菌等微生物中。

动植物天然来源的果胶酶产量低难于大规模提取制备,微生物才是生产果胶酶的优良生物资源[2]。

果胶酶类的应用领域非常广泛,不仅可用于食品工业如水果加工及葡萄酒生产等方面,还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理和饲料等行业中[1,3]。

黑曲霉是公认的安全菌株(G RAS:G enerally Regarded As Safe ),其代谢产物可直接用于食品工业,并且黑曲霉分泌的果胶酶系比较全[4]。

目前,工业用的果胶酶生产菌大多是通过黑曲霉固体发酵生产获得,但由于固体发酵规模生产受限且杂蛋白含量高,影响果胶酶的分离纯化[5,6]。

因此,筛选适合于液体深层发酵培养高产果胶酶菌株显得尤为重要。

本文基于18S rDNA 序列的系统发育学分析对筛选得到的高产碱性果胶酶的真菌进行鉴定,并对其液体深层发酵产酶条件进行初步优化,为下一步工业化生产或者分子育种提高果胶酶比活力奠定基础。

1　材料与方法1.1　材料1.1.1　菌株和质粒真菌EI M -4和E scherichia coil DH5α(φ80lacZ ΔM15),均由工业微生物教育部工程研究中心保存。

pM D -18T S im ple Vec 2tor 购自T aK aRa Biotechnology (dalian )C o.,Ltd.1.1.2　试剂DNA 限制性内切酶、X -gal 、IPTG 、Marker 购自T aK aRa Bio 2technology (dalian )C o.,Ltd.,胰RNA 酶(RNaseA )购自Biotech C o.,Ltd ,W ozard S V G el and PCR Clean -up System 购自Promega Biotech C o.,Ltd ,氨苄青霉素购自上海生工生物工程公司。

1.1.3　培养基(1)固体分离培养基:K 2HP O 40.1g ;M gS O 40.5g ;NaNO 3313g ;FeS O 40.01g ;果胶0.2g ;琼脂粉0.15g ;加水至1L ,自然pH;(2)基础固体培养基:马铃薯200g ;葡萄糖20g ;琼脂粉15g ;水1L ,自然pH ;(3)基础液体培养基:3%橘皮粉;2%麸皮;0.35%(NH 4)2S O 4;0.2%的CaC O 3。

1.2　方法1.2.1　菌株基因组DNA 的提取采用改良的S DS 裂解法提取真菌EI M -4的基因组DNA [7]。

1.2.2　引物设计根据丝状真菌(曲霉)的18S rDNA 基因的保守序列设计一对通用扩增引物(由上海生工生物工程公司合成),其中:正向引物P f :5’-T CC AACCTGG TTG AT CCTG CC AG T A -3’反向引物Pr:5’-CCTTG TT ACG ACTT C ACCTT CCT CT-3’。

1.2.3　18S rDNA基因的克隆以提取的基因组DNA为模版,以上述设计引物为扩增引物,克隆真菌EI M-4的18Sr DNA,PCR反应条件为94℃预变性5min;94℃变性35s,55℃退火35s,72℃延伸2min,30个循环, 72℃最后延伸10min。

PCR结束后取2μl产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检验,其余-20℃保存备用。