❖ cAMP［125I］分析系统，用于小量样品的分
析；
❖ cAMP ELISA测定方法，测定简便、敏感性 高（特异受体） 。
❖cAMP信号系统常用药理学试剂
❖ cAMP类似物：竞争性结合PKA调节亚基上的cAMP结合位 点，PKA的竞争拮抗剂，PDE不能水解，Rp-cAMP、SpCAMP
❖ 与PKA的底物结合位点竞争的抑制剂：结合C亚基的ATP结 合位点，抑制专一性低，异喹啉衍生物H89、KT5720
❖ 荧光测定仪器
荧光分光光度计：少用 流式细胞仪： 激光扫描共聚焦显微镜术（LSCM） 数字共聚焦显微镜
❖ Fluo 3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当 它与钙离子Ca2+结合后荧光会增加60至80倍，最大激发波 长为506nm，最大发射波长为526 nm。是目前最常用的一 种钙离子荧光探针。
❖ 上样量：目标蛋白量不应太低 ❖ 膜的选择：蛋白质的分子量（孔径） ❖ 封闭液：20%BSA→10%脱脂奶粉→10%马血清 ❖ 抗体：内参 ❖ 检测系统：辣根过氧化物酶-ECL ❖ 结果分析：背景过高：洗膜不充分、抗体浓度过高、封闭不充分；条
带过浅：抗体浓度不够、效价降低、曝光过短、蛋白含量低 ❖ Stripping buffer漂洗，去除一结合的一抗和二抗，多次使用
❖ 冻溶： -20或-80→4（一天） →室温 均匀摇晃，勿产生气泡，减少沉淀
❖ 组织提取物的制备：提取可溶蛋白（尽可能选 择含目标蛋白高的组织）
❖ 步骤及注意事项：
❖ 1、切成小块，放入预冷匀浆器，加入预冷缓冲液（2倍体积） ❖ 2、匀浆1-3min，若较长时间，则间隔1min ❖ 3、匀浆方法选择：有的组织在匀浆前先冷冻后有利于破碎；
常用：溶菌酶、β-1,3葡聚糖酶、蛋白酶等； 缺点：价格高，通用性差
❖ 化学渗透法：化学药品改变细胞壁或膜的通透性 有机溶剂（苯、甲苯）、表面活性剂（SDS、 TritonX-100）、金属螯合剂（EDTA产物 ❖ 其他：反复冻融法、渗透压法、干燥法
❖ 亲和标记法分离表面受体
❖ 亲和标记（affinity labeling）是常用的分离细胞表面受体 的方法
❖ 原理： 将细胞与超量标记的激素（配体）混合，以饱和所 有特异受体的激素结合位点。洗去多余的激素，然后加入能 够与受体和配体结合的共价交联剂将激素与受体进行共价交 联。
❖亲和标记胰岛素受体
❖ 大多数交联剂含有两个可与蛋白质中自由氨基相互作用的基 团， 当表面受体与配体结合后，配体和受体上各自的自由 氨基的距离靠近到足以被小分子的交联剂结合时，受体和配 体就会被交联在一起。
❖ 与交联剂共价结合的配体和受体能够耐受去垢剂和变性剂的 处理。
❖ 因而可用去垢剂和变性剂溶解细胞质膜，分离膜蛋白通过电 泳进行分析。
蛋白质表达水平和细胞内定位研究
❖ 信号蛋白分子表达水平及分子量检测 western blot analysis
❖ 信号蛋白分子在细胞内定位研究 immunohistochemistry/immunnocytochemistry Immunofluorescence（IF） Green fluorescent protein（GFP ，live cells）
激酶活性的测定
❖ 常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试 剂盒。
❖ 检测原理：根据激酶可以催化特定底物发生磷酸化，外源加入 32γ-ATP，通过分离反应产物后测定放射活性，从标准曲线推算 出样品酶的活性。
❖ PKC从胞质向胞膜的转位是PKC活化的一个重要指标，因而分 离胞质和胞膜中的PKC并分别测定其活性，计算胞膜上PKC活 性占总PKC活性的比例，从而判定PKC的活化程度。
❖ Fluo 3-AM是Fluo 3的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能 够轻易进入细胞中。 Fluo 3-AM进入细胞后可以被细胞内的 酯酶剪切形成Fluo 3，从而被滞留在细胞内。
❖ 激光共聚焦荧光显微镜具有氩激光器，所以Fluo 3可被广泛 使用于这种显微镜上。这种荧光信号发出来的长波也便于减 小对样品细胞的光损伤。
❖ 钙调素的定量测定
酶法：根据CaM依赖的酶（PDE、NAD激酶、 Ca-ATP酶等）激活的程度，使用广泛 免疫学法：RIA和ELISA（抗体，特异性强、测 定CaM的总量，非活性）
磷酸化的信号转导分子
❖ 酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残 基磷酸化
❖ 蛋白鉴定通常是首先分离粗提蛋白，采用针对 含这些氨基酸残基磷酸化蛋白的单克隆抗体进 行免疫沉淀,SDS-PAGE电泳，然而采用 Western blotting鉴定其分子量，进一步利用分 子生物学技术克隆信号蛋白，搞清其基因结构 和氨基酸序列。
信号转导的研究方法
受体
❖ 突变株的筛选（遗传学方法） 受体提纯（亲和层析） 标记配体法检测受体：
❖ 受体与配体相互作用研究方法 ：
（1）饱和实验，用于测定放射性配体对受体的亲和 力（K）以及结合位点的密度（Bmax）；
（2）抑制实验，用于测定未标记的竞争配体与受体 的亲和力（Ki）；
（3）动力学实验，用于测定放射性配体与受体的结 合速率常数（K+1）和解离速率常数（k-1）。
❖ IP3的测定
❖ 采用3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂 刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层 析柱分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进行液闪测定。
❖ D-myo-IP3［3H］分析系统直接测定粗提物中的IP3含量， 此方法简易、敏感（Amersham公司）。
钙信号
❖ 细胞内游离钙离子测定方法 ❖ 方法选择：
1、使用Ca2+特异性指示剂时，指示剂与Ca2+专一结合性强、亲 和力高，可以测定低浓度Ca2+ ；
2、尽可能获得Ca2+浓度绝对值； 3、测定Ca2+水平的变化比细胞内Ca信号引起的相关生理反应要
快； 4、指示剂与Ca2+结合不损害细胞内正常生理生化过程； 5、容易进入细胞并在胞质内扩散； 6、有可能显示胞内Ca2+分布。
❖ 饱和实验
常用于确定受体密度（受体的数目）在实验干预（如药物治疗）时的变 化。保持受体数不变而改变放射配体浓度可得到饱和曲线。从该实验中 可估计受体最大结合量（Bmax）和受体对放射性配体的解离常数 （Ka）。 ❖ 饱和实验的结果以结合配体数（与受体结合的放射性配体的浓度）为y 轴，游离配体数（未与受体结合的放射性配体的浓度）为x轴作图。当 放射性配体浓度增大时结合配体数逐渐增加，当达到某一点以后，再增 多放射性配体量也不引起结合配体数的显著增加。 ❖ 饱和曲线的最高趋近点所对应的y值，亦可代表所研究组织中的受体密 度。Kd为占据受体50％结合位点时的配体浓度。
❖ ［ Ca2+ ］i的测定 ❖ 细胞内Ca2+的测定方法有原子吸收光谱法、离
子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。
荧光法
❖ 水母发光蛋白法 ❖ 钙离子荧光探针法（目前常用），标记靶细胞
钙离子荧光探针 常用的 有Fluo-3 AM 、quin-2/Am、Fura2/Am及Indo-1等。
❖ 荧光探针的装载方法： 显微注射：水母发光蛋白和Dextran偶联的探针 酸化导入法：离子型探针（有些细胞无法导入） 常温孵育法：AM酯化的探针（在动物细胞应用广泛） 低温导入法：植物细胞，低温抑制细胞壁的酯酶
人工匀浆 ❖ 4、缓冲液的选择：使用中性PH、离子强度适当 ❖ 5、抑制蛋白酶的加入：根据蛋白质的可能降解情况加入（酶
抑制剂价格昂贵） ❖ 6、低温高速或超速离心 ❖ 7、超声的方法
细胞破碎与分离
❖ 破碎方法： 机械法： 非机械法：溶胞作用：酶溶法、化学法、物理法 ❖ 酶溶法：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解
❖ 同位素示踪：通过标记32P ❖ 磷脂分子的定性和定量：色谱、质谱的应用
脂组学
❖ DAG的测定 提取含DAG的样品，用DAG激酶催化底物DAG，使
之发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，最后将反应产物进 行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中 DAG的含量（Amersham公司生产的DAG分析系统）。
western blot
❖ SDS-PAGE→转膜（PVDF or NC） →封闭 →一抗→洗涤→标记二抗→洗涤→显色或化 学发光显影
❖ SDS-PAGE作用：确定蛋白质纯度、确定蛋
白质亚单位的分子量 ❖ 考染：检测含0.1ug蛋白质条带
银染：灵敏度高100倍
❖ 印迹膜上蛋白质染色：聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙 膜
环核苷酸信使系统
❖ cAMP/cGMP定性及定量测定 3H/125I标记cAMP/CGMP竞争结合分析系统 酶联免疫方法（ELISA) 色谱分离-质谱测定 细胞内实时测定：荧光共振能量转移（FRET）及生物分子 荧光互补（BIFC）
❖ cAMP［3H］分析系统，优点是放射性半衰
期长，可用于大量样品的分析；
免疫学法
❖ 蛋白质印迹：抗体（如抗p-Thr）、样品匀浆液加 入蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂或蛋白激酶抑 制剂；目标蛋白印迹发生移位
❖ 免疫组织化学：磷酸化蛋白在亚细胞定位和动态变 化
❖ 流式细胞术：荧光抗体
❖ 磷酸化蛋白组学
高分辨率质谱 磷酸酶抑制剂使用：钒酸钠（酪氨酸磷酸酶）、冈田 酸（丝/苏氨酸磷酸酶）、氟化钠、焦磷酸钠、甘油 磷酸钠（广谱、非特异磷酸酶）
❖ 生化实验检测
GTP结合实验：用GTP类似物[ γ-32P]GTP，检测G蛋白的存在，几种G蛋白的
特异性？
免疫印迹实验：抗体 GTPase活性实验：不同反应底物：同位素标记法（[γ-32P]GTP）；级联反
应荧光法（NADH，GTPase、丙酮酸激酶和LDH）
❖ 分子遗传学手段
借助G蛋白突变株（功能缺失突变株、显性负突变株、功能 获得突变株）