Meta
宏
基
因
组
研
究
思
路
基于单独分离培养的 方方法研究微生生物，只 能获取不超过5%的微 生生物种类，而而超过 95%的微生生物是不可 培养的！
采用用Meta研究方方法， 直接对整个群落提取 DNA，进行行建库测 序，获取全部序列信 息，不需要经过培养， 获取信息更完整。
1. 添加ASP250喂养后，拟杆菌 ⻔门、 梭菌等显著减少，奇异球 菌-栖热菌⻔门和变形菌⻔门显著上 升，其中变形菌⻔门从1%上升到 11%； 2. 不添加ASP250喂养，猪肠道中 也有很多耐药因子子，但添加后 使抗生生素失活的酶组分降低、 外排泵系统和保护抗生生素的活 力力显著增加。
材料背景 研究思路
Metagenome
➢采用用高高通量测序进行行的宏基因组研究
Metagenome
In humans, microbes • provide protection against foreign invaders, • educate and stimulate the immune response, • produce antimicrobials, • aid in digestion, • produce vitamins, • among a host of other functions.
结果讨论 Looft, T., T. A. Johnson, et al. "In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome." Proc Natl Acad Sci U S A 109(5): 1691-6.
图A：不同样品0和14天耐药因子子的差别
NTS rDNA-repeat NTS rDNA-repeat
ETS1
18S rDNA
ITS1
5.8S rDNA
ITS2
28S rDNA
ETS2
ITS
➢测序区域： 454：ITS1，ITS2，ITS，18S Miseq：ITS，18S
北京雾霾颗粒中微生生物群落的研究 16S+18S
空气气中收集PM2.5和PM10 颗粒样本（主要污染源之 外的地点），分别从 PM2.5和PM10颗粒样本中 提取DNA进行行全基因组 测序分析 使用用测序数据中 的16S和18S数据 分别进行行细菌、 真菌和病毒的物 种注释，进行行物 种丰度比比较分 析. 1. PM样本中细菌所占的微生生物比比例非非 常大大，而而且大大部分的细菌都与土土壤的 微生生物组成相似； 2. 发现PM样本中存在部分已知的病原 菌，包括：肺炎双球菌 (Streptococcus pneumoniae)，烟曲 霉菌(Aspergillus fumigatus)和腺病 毒(human adenovirus C) 等; 并且随 着雾霾的持续，这些病原菌成分会逐 步上升。
群落结构分析介绍 宏基因组分析介绍
数据分析操作（基于16S数据）
答疑讨论
Metagenome
物种分类
基于reads比比对的物种分类和丰度统计
基因组组分
组装，基因预测，特殊元件（CRISPR等）
宏基因组
基因功能
通用用数据库功能注释，KEGG, GO， ARDB等
差异比比较
物种组成差异，功能基因差异
ITS
➢ITS：（Internal Transcribed Spacer，内部转录间隔区）：属于中度保守区域，种内 相对一一致，种间差异相对明显，长度在450-750之间。 由于18S不像16S，具有较少的高高变区，进化速率慢，没有ITS快（是18S的10倍）， 多用用于系统发育。 ➢ITS结构：
微生生物群落
微生生物总DNA
微生生物总RNA
PCR扩增特定区域
特定区域区测序
宏基因组调查
宏转录组调查
微生生物多样性分析 •物种分类 •OTU分析 •物种丰度分析 •多样品间差异比比较
微生生物群落物种分类 功能组成以及代谢网网络研究 •基因预测 •功能注释 •物种分类 •物种及基因功能差异
检测差异表达基因 筛选高高活性微生生物 •基因预测 •物种及功能注释 •基因表达差异统计
Metagenome
396个人人样本的测 序数据 通过组装得到基因集 3,871,657个基因
Reads比比对到核心心 基因集完成单独到组 装
选取seed基 因，根据丰度信息 构建核心心基因集
最终组装出 238 个独特的基因组草图，构建 7381 个 CAGs(co-abundance gene groups)
Hiseq 2000, 100PE
16S rDNA
可变区 V1-V2 V3 V4 V5-V6 V6 V6-V7 V7 V7-V8
引物位点 27-355 338-548 530-826 805-1065 967-1065 967-1238 1046-1238 1046-1406
与16S全长比比较 高高估(1.2) 低估(0.88) 接近(0.97) 接近(1) 高高估(1.67) 接近(0.98) 低估(0.6) 低估(0.65)
群 落! 整! 体! 研! 究! 思! 路!
!
!
群落结构分析介绍 宏基因组分析介绍
数据分析操作（基于16S数据）
答疑讨论
Tools
✓EstimateS: /estimates ✓R: ✓Mothur: / ✓Qiime: ✓ USEARCH: /usearch/ ✓Others: DOTUR, Chimera_Check.
!
图B：Beta内酰胺酶、四环素外排泵、磺 胺类药抗性因子子、氨基糖苷类磷酸转移酶等 在使用用ASP250 14天后显著增加 图C：不同样品0和14天物种组成分差别比比 较大大的几几个物种
Meta-transcriptome
基因预测
组装，基因预测
宏转录组
基因功能
通用用数据库功能注释，KEGG, GO等
手手术所需的粪便；并进一一步开发“粪便胶囊”，替换传统的抗生生素治疗。
Classical methods
• Categorize: ∼17 morphologies • 个体大大小小: • 形状与排列: 杆菌，球菌，弧菌…… • 细胞结构: 鞭毛毛，芽孢，荚膜，纤毛毛…… • 菌落形态：菌落颜色色，大大小小，光泽…… • 生生理生生化指标：营养类型，碳源谱，氮源谱…… • 致病性……
材料背景
研究思路
结果讨论
Kembel, S. W., E. Jones, et al. "Architectural design influences the diversity and structure of the built environment microbiome." ISME J 6(8): 1469-79.
Database
Name Greengene RDP Silva UNITE ITS2 Assembling the Fungal Tree of Life (AFTOL) ITSoneDB FunGene Focus Bacteria,Achaea Bacteria,Achaea Bateria,Achaea,eu karyon Root-associated fungi ITS2 Fungal phylogeny Fungi ITS1 Sequecne data on-line 16S 16S 16S,18S,23S,18S ITS ITS2 SSU, LSU, ITS, RPB1, RPB2, mitSSU, mitATP6,TEF1 ITS1 FunctionGene URT /cgi-bin/ nph-index.cgi / http://www.arb-silva.de/ http://unite.ut.ee/ http://its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/ r.it:8080/ITS 1/ /
抗生生素添加剂对猪肠道菌群环境的影响：! 16S rDNA+宏基因组
1. 0和14天分别取样；
用用添加促生生⻓长的 ASP250（含⻘青霉素、 磺胺甲嘧啶、氯四环 素等多种抗生生素）和 正常饲料喂养的猪（给 三头）。 2. 提取DNA，进行行16S rDNA的 V3区扩增测序，分析 ASP250对肠道物种组成的影 响； 3. 通过宏基因组，分析添加 ASP250对功能和耐药因子子的 影响。
!
Meta-transcriptome
基因芯片片结合宏基因组和宏 12天连续发酵过程中不 同时间的韩国泡菜发酵 液样品，发酵液ph值下 降过程中选取4个代表 时间点进行行宏基因组和 宏转录组分析。 材料背景 研究思路 转录组分析：构建了针对 39种乳酸菌的特异性基因 组探针芯片片(genome probing microarrays， GPM)，用用来研究韩国泡菜 发酵过程中微生生物的多样性 及其基因表达的情况。
NAM Y D, CHANG H W, KIM K H, et al. Metatranscriptome analysis of lactic acid bacteria during kimchi fermentation with genome-probing microarrays[J]. International Journal of Food Microbiology 2009, 130(2): 140-146.
表达差异
基因表达量，差异表达聚类及功能显著性富集等
韩国泡菜的宏基因组+宏转录组研究
1. 基于宏基因组结果：明串珠菌 （Leuconostoc）、乳杆菌属 （Lactobacillus）和魏丝氏氏菌 属（Weissella）为发酵过程中 优势菌属，4种主要的乳酸菌比比 例都超过了5%； 2. 宏转录组分析发现有23种乳酸 菌与泡菜的发酵有关，宏转录 组的分析结果表明除两种微生生 物外所有的乳酸菌都对泡菜发 酵有影响，即使丰度较低的微 生生物在泡菜发酵过程中也有着 积极的作用用。 结果讨论