噬菌体抗体库技术的诞生和迅速发展,则为犬瘟热的防治研究提供了新的思路和方法。
噬菌体展示技术的出现使抗体工程进入第三次革命。
噬菌体展示技术目前以噬菌体展示抗体的应用最为成熟,噬菌体抗体库技术是噬菌体表面展示技术在基因工程抗体应用上的一个成功范例。
它可以模拟体内B淋巴细胞受到刺激后分化、成熟直至分泌抗体的过程。
建库时一般先从外周血淋巴细胞或脾细胞中提取RNA,设计核酸引物,用PCR技术扩增出所需要的整套的抗体基因片段,通过抗体轻链和重链基因的随机重组,构成单链抗体基因,如Fab或scFv,将其插入噬菌体或噬菌粒表达载体中,与噬菌体外壳蛋白基因连接,感染大肠杆菌并以融合蛋白的形式使抗体片段表达展示于噬菌体表面,形成含有全套抗体谱的噬菌体抗体库。
利用抗原-抗体的特异性结合进行淘选,获得能与抗原特异性结合的阳性克隆。
噬菌体抗体库技术是基于噬菌体表面展示技术发展起来的一项基因抗体工程新技术。
它将含亿万种基因的抗体可变区基因库转化成展示在噬菌体表面的蛋白库,不仅使对于具备所需属性的单克隆抗体筛选能更方便、快速、高效地在体外进行,还开辟了单克隆抗体的新途径,揭开了单克隆抗体生产的历史新篇章。
噬菌体展示技术不需经过杂交瘤,甚至不需经过免疫,直接从B细胞mRNA反转录的cDNA扩增出抗体基因,避免了从取脾细胞融合到获得稳定克隆株的繁琐过程。
用杂交瘤技术制备单克隆抗体是抗体工程中最经典的方法,噬菌体展示技术与之相比,具有很多优点:它的筛选范围从几千扩大到几百万甚至几亿,可筛选不同亲和力的抗体,而且简单、快速、高效。
利用此项技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体,随着此项技术的发展,噬菌体抗体库技术将为未来十年的药物研制和靶分子确定提供研究工具和发展平台。
噬菌体抗体库技术发展至今,已可在两周内根据各种分子筛选出相应的具有高亲和力的抗体。
它在考虑到抗体分子的大小、价数、亲和力及效应区功能的同时简化了抗体生产程序。
McCafferty按照设计的实验步骤将Fabs,单链Fv展示于丝状噬菌体表面,噬菌体抗体库产生的抗体有中度的亲和力,分离常数在10-5 mol/L~10-8mol/L时,展示的抗体可被靶分子结合而被筛选出来。
除此之外,抗体片断还可通过某些方法如形成二聚或多聚体分子来增加结合部位,以达到增加抗体的亲和力或价数的目的。
噬菌体抗体库技术诞生以来,由于方便、快速、高效等特点,其应用得到了迅猛发展。
目前用于临床实验的人类抗体中,有30%是由噬菌体抗体库技术获得。
临床上发展最为成熟的噬菌体抗体D2E7-抗TNF2IgG1抗体,已经申请用于临床治疗风湿性关节炎。
运用噬菌体抗体库技术,已建立起了多种抗体库(合成的,天然的,svFv,Fab等) 和肽库(线性的,环形的等)。
噬菌体抗体库技术一诞生,就在抗病毒抗体研究中显示强大功能,多种类型抗体库得到建立,多株针对不同病毒的抗体已被分离得到。
针对多种不同病毒抗原的单克隆抗体片段或功能性肽段也已筛选得到并已用于病毒性疾病的检测和诊断。
噬菌体抗体库技术目前已广泛应用于筛选针对SARS-CoV、埃博拉病毒、HIV、流感病毒和乙型肝炎病毒的抗体,其他各种人类病毒的抗体,如呼吸道合胞病毒(RSV)、丙肝病毒(HCV)等。
除此之外,针对口蹄疫病毒、狂犬病毒等以及多种植物病毒如葡萄扇叶病毒等的噬菌体抗体库研究都已广泛开展,多株特异性噬菌体抗体已被筛选得到并已用于疾病检测和诊断。
随着连续抗原淘选等方法的发明及应用,噬菌体抗体库技术将为病毒性疾病的特异治疗带来新的发展。
鉴于目前的各种CDV检测方法存在一些难以克服的缺点, CDV疫苗还存在很多的不足之处。
应用噬菌体抗体库技术可筛选出抗犬瘟热病毒抗体,经载体表达出可溶性svFv(single chain variable fragment)。
可溶性svFv具有穿透力强、容易到达靶细胞等优点,可广泛应用于犬瘟热病毒的检测及犬瘟热病的治疗和致病机理研究。