第二章餐厨垃圾堆肥产酶菌株筛选2 材料与方法2.1 材料2.1.1 实验材料1）筛选材料：HM菌剂（河南恒隆态生物工程股份有限公司）；EM菌剂（江西天意集团）；金宝贝菌剂（北京华夏康源科技有限公司）；群林发酵剂（广西北海群林生物工程有限公司）。
2）发酵材料：餐厨垃圾（购自贵州大学南校区学生食堂）；稻草（购自铜仁市，晒干后粉碎至5mm左右）。
2.1.2 主要药品及试剂2.1.3 实验仪器电子分析天平（EL-2005）西特传感技术有限公司高速台式离心机（TGL-161）Thermo公司冷冻离心机（2-16k）德国eppendorf公司标准型净化工作台上海锦星科学仪器有限公司低温冰箱〔BCD-108E）风华电器厂超低温冰箱(Forma-6C ULT) Thermo公司调温调湿箱（WS/08-01）重庆试验设备厂干燥箱（101-2）上海实验仪器总厂自动三重水蒸馏器（SZ-97）上海亚荣生化仪器厂高压灭菌锅（GMSX-280）英国阿斯太欧（Astell）公司循环水浴锅（RET7）Thermo公司电热恒温培养箱（DH3600) 天津泰斯特仪器有限公司恒温摇床（SKY-2102C) 上海苏坤实业有限公司高速组织捣碎机（DS-1) 上海标本模型厂磁力双向搅拌器（90-1）上海亚荣生化仪器厂pH计ACS交直流两用电子计价秤昆明金瑞克电子衡器有限公司双金属温度计（WSS-411）天津市新华热工仪表有限公司河北铁狮磨浆机械有限公司秸秆揉丝饲料粉碎多用机（9R-30)紫外分光光度计2.1.6 培养基1）初筛培养基（1）细菌培养基（%）：牛肉膏0.3；蛋白胨1.0；氯化钠0.5；琼脂粉2.0；pH7.2 （2）霉菌培养基（%）：磷酸二氢钾0.1；七水硫酸镁0.05；蛋白胨0.5；葡萄糖1.0；琼脂粉2.0；孟加拉红0.03；pH自然；链霉素30μg/m L（3）乳酸菌培养基（%）：蛋白胨1；牛肉膏1；酵母膏0.5；柠檬酸二铵0.2；葡萄糖2.0；吐温80 0.1；乙酸钠0.5；三水磷酸氢二钾0.2；七水硫酸镁0.058；七水硫酸锰0.025；琼脂粉2.0；pH6.2（4）放线菌培养基（%）：可溶性淀粉2；氯化钠0.05；硝酸钾0.1；磷酸氢二钾0.05；七水硫酸镁0.05；七水硫酸亚铁0.001；重铬酸钾0.015；琼脂粉2.0；pH7.4；青霉素3μg/ml2）复筛培养基（1）产淀粉酶筛选培养基（%）：可溶性淀粉0.2；蛋白胨1.0；酵母膏0.5；磷酸氢二钾0.3；七水硫酸亚铁微量；七水硫酸镁微量；琼脂粉2.0；pH7.0【陈秋红,孙梅,施大林,等.益生菌酪酸菌CB-7发酵培养基及培养条件的研究.科学试验与研究[J].2009,4:7-10,21】（2）产脂肪酶筛选培养基（%）：硫酸铵0.1；磷酸氢二钾0.1；氯化钾0.05；七水硫酸镁0.01；橄榄油1.0；聚乙烯醇0.1；琼脂粉2.0；pH8.5【刘敏,曹志军,焦艳芬,等. UHT 乳中产耐高温脂肪酶嗜冷菌的研究[J]. 内蒙古农业大学学报.2008,29(1):230-233】（3）产纤维素酶筛选培养基（%）：七水硫酸镁0.01；羧甲基纤维素钠1.5；氯化钙0.01；磷酸二氢钾0.05；硫酸铵0.2；磷酸氢二钾0.2；pH自然【刘胜贵,严明,邹娟,等.纤维素降解真菌的筛选及其产酶条件[J]. 中国农学通报,2011,27(7):102-106】3）产酶发酵液（1）产淀粉酶发酵液（%）[1]：可溶性淀粉0.5；蛋白胨0.5；酵母膏0.5；氯化钠0.1；七水硫酸亚铁微量；七水硫酸镁微量；pH7.0（48h培养）【陈秋红,孙梅,施大林,等.益生菌酪酸菌CB-7发酵培养基及培养条件的研究.科学试验与研究[J].2009,4:7-10,21】（2）产脂肪酶发酵液（%）：蛋白胨2.0；葡萄糖0.58；橄榄油乳化液4；硫酸铵0.1；七水硫酸镁0.05；磷酸氢二钾0.1；pH自然（72h培养）【胡朝阳,韦晗宁,李春苑,等.产脂肪酶菌株的筛选及酶学特性研究[J]. 广西农业生物科学,2006,25(3):261-268】（3）产纤维素酶发酵液：A液：葡萄糖0.4g；七水硫酸镁0.25g；CMC-Na 0.5g；水89mL; B液：磷酸氢二钠6.0g；氯化钠0.5g；磷酸二氢钾3.0g；氯化铵1.0g；水100mL; C液：氯化钙0.11g；水100mL灭菌后10mLB液+1mLC液+89mLA液即为发酵液【雷正玉,何力,王朝元,等.草鱼体内产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件的研究[J]. 微生物学杂志,2007,27(4):54-57】4）基础培养基（%）：蛋白胨1.0；酵母膏0.5；氯化钠1.0；琼脂粉2.0；pH7.02.1.7 溶液配制0.5%淀粉溶液配制：0.5g可溶性淀粉加入10mL水混合成糊状，加入95mL沸水，微沸几分钟。
静置、冷却，取上清即得。
0.1mol/L H2SO4溶液配制：取10.9mL浓硫酸定容至100mL，即为1mol/LH2SO4溶液。
取10mL，1mol/LH2SO4溶液定容至100mL，即为0.1mol/L的H2SO4溶液。
碘液的配制：称取2.0g碘化钾溶于10mL蒸馏水中，加入1.0g碘，迅速搅拌使其溶解后加水定容至300mL。
即0.1mol/L的卢卡氏碘液；取0.4mL 0.1mol/L碘液定容至100mL即得0.4mmol/L碘液。
4%聚乙烯醇溶液配制：称取40g聚乙烯醇(PV A）加蒸馏水约800mL，在沸水浴中不断搅拌使其完全溶解，冷却后定溶至1000mL，再经纱布过滤后备用。
橄榄油乳化液的配制：取4%聚乙烯醇溶液150mL，加50mL橄榄油，高速组织搅动机搅动6min(分2次搅动，每次3min，中间休息5min中)，即制成乳白色的橄榄油乳化液。
磷酸盐缓冲液配制：0.025mol/L，pH值7.5。
甲液：称取17.01gKH2PO4，加水定容至500mL；乙液：称取44.77gNa2HPO4·12H2O，加水定容至500mL；吸取13mL甲液与100mL 乙液混匀即成0.25mol/L磷酸缓冲液，使用时用水稀释10倍，即成0.025mol/L 磷酸盐缓冲液。
0.05mol/L Na OH溶液配制：取4.58g固体Na OH溶于1L水中，用邻苯二甲酸氢钾标定，使用时稀释10倍。
酚酞溶液配制：取1g酚酞溶于100mL 95%的乙醇中即得10g/L的酚酞溶液；取0.5g酚酞溶于100mL 95%的乙醇中即得5g/L的酚酞溶液【GB/T 603-2002化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备】Na2CO3-NaHCO3缓冲液配制：0.1mol/L，pH10。
0.1mol/LNa2CO3溶液：称取28.62g Na2CO3·10H2O溶解、定容至1L，即为0.1mol/LNa2CO3溶液；0.1mol/LNaHCO3溶液：称取8.40gNaHCO3溶解、定容至1L，即为0.1mol/LNaHCO3溶液。
使用时将Na2CO3溶液与NaHCO3溶液1:1混合即得0.1mol/L，pH10的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
1%CMC-Na溶液配制：称取1gCMC-Na溶解定容至100mL即得。
DNS试剂配制：称取酒石酸钾钠182.0 g，于500 mL 蒸馏水中，加热搅拌，依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3 g，Na OH 21.0 g，苯酚5.0 g，搅拌至完全溶解，冷却后用蒸馏水定容至1 000 mL，棕色瓶中室温暗处放置一周后使用。
【张龙翔,张庭芳,李令媛. 生化实验方法和技术[M]. 北京:人民教育出版社,1982:9-11】2.2 方法2.2.1 样品组成菌株的分离纯化1. 各称取商品菌剂（HM菌剂、金宝贝菌剂、群林菌剂、EM菌剂）10g（或10mL）置于盛有90mL无菌生理盐水，含玻璃珠的三角瓶中，37℃，180r/min震荡60min，将菌剂打碎。
取上清作为10-1，依次稀释至10-2,10-3,10-4,10-5。
2. 吸取100μL稀释好的菌液涂布初筛培养基平板，三组平行实验。
3. 将涂布好的平板及其平行组分别置于28℃，45℃，55℃的恒温培养箱中培养（细菌、乳酸菌培养2d；霉菌培养3-5d；放线菌培养7d）。
4. 用接种环挑取分离出的单菌落在相应的分离培养基平板上划线纯化，并置于分离温度下培养至长出单菌落。
5. 挑取4.中的单菌落在相应的分离培养基斜面上划线，分离温度下培养，4℃保存。
2.2.2 产淀粉酶菌株的筛选2.2.2.1 初筛水解圈的测定1. 将保种菌株平板划线活化后，挑取单菌落在产酶筛选培养基平板上点种，分离温度下培养1-2d。
2. 培养结束后在平板上滴加1-2mL 0.1mol/L的碘液，（尽量避免滴加到菌落上）显色后测量菌落直径（d）与水解圈直径（D），并计算D/d的比值以此判断待测菌株对淀粉的分解能力。
3. 选出D/d比值较高的菌株，重新编号。
2.2.2.2 复筛酶活的测定[叶应妩，2006]【叶应妩,王毓三.全国临床检验操作规程[M ] 第3 版. 南京市:东南大学出版社, 2006】1.用牙签挑取初筛菌株保种斜面上的菌落，置于分离培养基液体试管中，180r/min，分离温度下培养活化。
2. 吸取1mL OD620值在0.6左右的菌液，置于含100mL产酶培养液的三角瓶中，180r/min, 50℃震荡培养2d。
3. 培养后的产酶发酵液4℃，7000r/min，离心取上清作为酶液。
4. 取5mL ，0.5%的可溶性淀粉溶液加入到试管中，40℃水浴预热10min 。
5. 加入5ml 酶液，反应5min 后用5mL0.1mol/L H 2SO 4终止反应。
5. 取5mL 反应液与5mL0.4mmol/L I2-KI 溶液显色，620nm 测OD 值。
（以0.5ml 水代替0.5mL 反应液为空白，以同批配置的淀粉酶空白发酵液离心上清为对照）。
6. 将OD 620值代入以下公式计算酶活力：D R R R L U ⨯⨯-=50m /00）酶活力（ R0：对照的碘液光吸收值；D ：酶稀释倍数；R ：反应液的光吸收值（调整D 使00R RR -在0.2-0.7之间，确定40℃，5min 内水解1mg 淀粉的酶量为一个活力单位）。
7. 依据水解圈比值D/d ，及体外酶活测定值，选出3株酶活较高且稳定性较好的菌株作为后期研究菌株。
2.2.3 产脂肪酶菌株的筛选2.2.3.1 初筛水解圈的测定1. 将保种菌株平板划线活化后，挑取单菌落在产酶筛选培养基平板上点种，分离温度下培养3d 。
2. 培养结束后直接测量菌落直径（d ）与水解圈直径（D ），并计算D/d 的比值，以此判断待测菌株对淀粉的分解能力。