合成脲酶的微生物才能分解尿素，以 尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由 于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长 发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养 基就能够选择出分解尿素的微生物。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4`7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g ①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属 于哪类培养基？ 固体培养基 选择培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按 对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个 小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板, 除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格 (即80个小方格)的酵母菌数. (6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方 格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左 方线上的酵母细胞). (7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计 算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.
• 抑制非目的微生物生长
• 从混杂微生物中分离目的微生物
1、利用选择培养基进行直接分离
选择培养基 只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其 他微生物生长的培养基
选择培养基
可抑制细菌、放线 菌细胞壁主要成分 肽聚糖的合成
其细胞壁是由纤 维素、几丁质、 葡聚糖组成
加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入四环素、卡那霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 ④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以 三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌 落数在50个左右为最好。
三.结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染， 菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则 菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出 分解尿素的微生物。
纯化细菌
微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。
1.平板划线法
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集
的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
2.稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂 布到琼脂固体培养基的表面进行培养。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个
一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养； 单个微生物只在固体培养基上形成菌落； 在液体培养基中不会形成菌落
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、 光泽、质地、颜色和透明程度等。每一种 细菌在一定条件下形成固定的菌落特征。 不同种或同种在不同的培养条件下，菌落 特征是不同的。这些特征对菌种识别、鉴 定有一定意义。
刚果红染色法
刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与
水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物 时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时， 可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚 果红 染成红色的纤维素分解了。
血球计数板计数室有两种刻度
* * # #
# * 1大格=16中格 25×16=400小格 *
# 1大格=25中格 16 ×25 =400小格
#
3.计算公式 (1)16格×25格的血球计数板计算公式: 酵母细胞数/ml= 100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数 (2)25格x16格的血球计数板计算公式: 酵母细胞数/ml= 80小格内酵母细胞个数/80×400×104×稀释倍数
细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布 平板操作。
（二）、纯种平板分离的不同方法
104/ml
103/ml
102/ml
101/ml
从土壤中分离纯微生物
1、涂布平板法（spread plate method)
涂布平板法
稀释倒平板法
2、稀释倒平板法（倾注平板法）（pour plate method)
细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的 pH升高。
分解纤维素的微生物的分离
（一）纤维素与纤维素酶
纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，
广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。
纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、Cx
酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分 解成葡萄糖。 C1酶 葡萄糖 葡萄糖 纤维素 纤维二糖 Cx酶 苷 酶
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
1、显微镜直接计数：利用血
球计数板，在显微镜下计算一定容积里样 品中微生物的数量
缺点
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数
计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个 槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半， 其上各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格， 中央的一大格作为计数用，称为计数室。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板， 则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如 果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试 验不精确，需要重新实验。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30— —300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三 个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出 菌落平均数。
3、平板划线法（streak plate method）
第一区划线
分区划线法（蛇形线法）操作图
灭菌接种环
第二区划线
用于浓度较大的样品
连续划线法操作图
连续划线法适用范围： 适用于浓度较小的样品
二、选择培养分离
原理
• 创造适于目的微生物生长条件 • 促使目的微生物快速生长呈优势菌
（一）、微生物纯种分离的原理和方法
分散成单个微生物
微生物样品 某种方法 多种混杂 平板 每个菌落为纯种（纯培养） 培养 单菌落
单菌落转接培养
纯种（纯培养）
一、用固体培养基（营养琼脂平板） 分离纯种
平板分离法：将单个微生物分离和固定在固 体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物 体经过生长、繁殖均可形成单个菌落
血球计数板的使用
以计数酵母菌为例 (1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数. (2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小 方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可. (3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加 盖专用的厚玻片. (4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻 片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取, 捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.
微生物纯种分离 • 将多种混杂微生物，经某种技术或方法 分离成纯种的过程 纯培养（pure culture） • 在适宜条件下培养纯种获得的培养物 （群体）
菌落 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内 部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可 见的、有一定形态结构的子细胞群体，称 为菌落(colony)。
2.间接计数法（活菌计数法）
稀释涂布平板法。 （1）常用方法：
（2）原理：
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大 约含有多少活菌。
二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层 土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农 作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才 能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2)2 +H2O
脲酶 NH3 + CO2
原理：培养基的氮源为尿素，只有能
2.提示：选择每个平板上长有30—300个 菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。 同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相 差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。
三、课 题 延 伸 能分解尿素的细菌的鉴定
鉴定的原理： 鉴定方法： 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，利 用此培养基进行细菌培养，观察培养基的颜色变化。
前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数 的平板
㈣.取样涂布
◆实验时要 对培养皿作 好标记。注 明培养基类 型、培养时 间、稀释度、 培养物等。
第二节 分离特定的微生物并测定 其数量
• 用固体培养基分离、培养 • 用液体培养基分离、培养 • 单孢子分离 • 选择培养分离 • 二元培养物分离、培养
微 生 物 分 离 方 法
要分离微生物，必须根据它的特点，包括营养、生 理、生长条件等，采用选择培养的方法，经过一定 时间的培养后，使这种微生物在群落中的数量不断 增加，在通过平板稀释法等进行纯培养分离