现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你怎样运传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。
方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。
结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。
由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。
大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。
枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。
实验十肠杆菌科肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。
多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。
根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。
一、大肠埃希菌大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。
当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。
从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。
因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。
（一）形态与培养特性【材料与方法】1．大肠杆菌革兰染色标本片。
2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。
【结果】1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。
2．菌落特征(表10-1)。
表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征培养基菌落特征普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落SS平板呈红色中国蓝平板呈蓝色伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽（二）生化反应【材料与方法】1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。
2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。
3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。
【结果】大肠杆菌生化反应结果(表10-2)。
表10-2 大肠杆菌及产气杆菌5种糖发酵、双糖铁、IMViC试验结果上层下层葡乳麦甘蔗吲哚甲基红VP 枸橼酸盐乳H2S 葡动力大肠杆菌⊕⊕⊕⊕ d + - ⊕ + + + - -产气杆菌⊕⊕⊕⊕ + + - ⊕ + - - + +二、沙门菌属沙门菌属(Salmonella)为一群生化反应、抗原结构相似的革兰阴性杆菌，血清型别繁多，对人致病的有伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌、希氏沙门菌、肠炎沙门菌，鼠伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌等，可引起人致伤寒、副伤寒、胃肠炎和败血症等疾病。
（一）形态与培养特性【材料与方法】1．伤寒沙门菌革兰染色标本片、鞭毛染色标本片。
2．伤寒沙门菌，甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌在普通琼脂平板，中国蓝平板，SS平板，伊红美蓝平板18~24h培养物。
【结果】1．伤寒沙门菌为革兰阴性杆菌，分散排列，鞭毛呈粗大、大波浪形。
2．菌落特征：伤寒、副伤寒沙门菌菌落特征一致(表10-3)。
表10-3 伤寒、副伤寒沙门菌在普通琼脂平板、选择鉴别培养基上的菌落特征培养基菌落特征普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，半透明，边缘整齐光滑SS平板较小，淡黄色，半透明中国蓝平板较小，淡红色半透明伊红美蓝平板较小，无色，半透明（二）生化反应【材料与方法】1．取伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。
2．取伤寒沙门菌，甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。
3．吲哚试验、尿素分解试验见实验四。
【结果】生化反应结果(表10-4)。
表10-4 伤寒、副伤寒杆菌主要生化反应结果细菌葡乳麦甘蔗动力H2S 吲哚尿素伤寒杆菌+ - + + - + + - -甲型副伤寒杆菌⊕ - ⊕⊕ - + d - -肖氏沙门菌⊕ - ⊕⊕ - + + - -（三）肥达(Widal)试验【原理】用已知的伤寒沙门菌O、H抗原和甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌、希氏沙门菌H抗原的诊断菌液与待检血清作定量凝集试验，以测定待检血清中有无相应抗体存在，作为伤寒、副伤寒诊断的参考，一般间隔5～7d重复采血检查，如抗体效价随病程进展而上升，即有诊断价值。
【材料】1．伤寒沙门菌O、H抗原菌液，甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌H抗原菌液，生理盐水，待检血清。
2．试管、1ml吸管、试管架、37℃水浴箱等。
【方法】1．取清洁试管32支，分成4排，每排8支，依次编号(表10-5)。
2．于试管内各加入生理盐水0.5ml。
3．在每排第1管各加1∶10的待检血清0.5ml，用1ml吸管吹吸数次，充分混匀，吸出0.5ml注入第1排第2管作对倍稀释，依次稀释至第7管，从第7管吸出0.5ml弃去，第8管为对照。
同法将第2、3、4排依次作对倍稀释。
表10-5 肥达氏反应操作程序(单位：ml) 管号 1 2 3 4 5 6 7 8生理盐水0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.51∶10待检血清0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃去0.5诊断抗原0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5血清稀释度1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 -结果4．从第8管开始，从后向前，于第1排各管内加入伤寒沙门菌H抗原菌液0.5ml；于第2排各管内加入伤寒沙门菌O抗原菌液0.5ml；第3排各管分别加入甲型副伤寒沙门菌H 抗原菌液0.5ml；第4排各管内分别加入肖氏沙门菌H抗原菌液0.5ml。
5．加完菌液，振荡试管架，混匀，置37℃水浴箱孵育16～18h后观察结果。
【结果】凝集程度，以“+”多少表示。
+ + + + 最强，上液澄清，细菌全部凝集于管底。
+ + + 强，上液轻度混浊，细菌大部分凝集于管底。
+ + 中强，上清半混浊，细菌部分凝集。
+ 弱，上液混浊，细菌少部分凝集。
-不凝集，液体呈乳状与对照管相同。
效价判定：对照管均不发生凝集时，依次观察试验管。
以使凝集呈“+ +”反应的血清最高稀释度为其凝集效价。
三、志贺菌属志贺菌属(Shigella)是细菌性痢疾的病原菌，俗称痢疾杆菌。
细菌由消化道侵人肠道，靠侵袭力和毒素致病，毒素入血可引起毒血症。
本菌属的形态特点为革兰阴性杆菌，无鞭毛，但菌体周围有菌毛。
除宋内志贺菌个别菌株迟缓发酵乳糖外，均不分解乳糖。
根据生化反应及抗原不同可分为四群：A群(痢疾志贺菌)，B群(福氏志贺菌)，C群(鲍氏志贺菌)，D群(宋内志贺菌)。
目前，我国以福氏志贺菌最多见，宋内志贺菌逐年增多，其他较少见。
（一）形态与培养特性【材料与方法】1．痢疾杆菌革兰染色片。
2．痢疾杆菌普通琼脂平板，中国蓝平板，SS平板，EMB平板培养物。
【结果】1．为革兰阴性杆菌，分散排列。
2．菌落特征，同伤寒沙门菌。
注：宋内志贺菌个别菌株可迟缓发酵乳糖，培养2～10d，菌落特点可接近大肠杆菌菌落特点。
（二）生化反应特性【材料与方法】1．葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵试验。
2．双糖铁培养试验。
3．吲哚试验。
【结果】生化反应结果(表10-6)。
表10-6 痢疾杆菌糖发酵、双糖铁、吲哚试验结果细菌葡乳麦甘蔗动力H2S 吲哚痢疾志贺菌+ - + - d - - d福氏志贺菌+ - + + d - - d宋内志贺菌+ ﹡ + + + - - -注: ﹡：迟缓发酵；＋：产酸；－：不发酵；d：某些菌株阳性四、粪便标本中致病性肠道杆菌的分离与鉴定正常情况下肠道中有多种细菌寄生，包括大量的厌氧菌和大肠杆菌、变形杆菌、粪产碱杆菌等。
本实验的目的主要是分离沙门菌属及志贺菌属中的某些致病菌。
【标本采集】粪便中细菌极多，为此，粪便的微生物学检查常根据检验目的菌的不同而选择不同培养基或用适当方法处理，尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。
但并不是粪便标本的采集无须注意杂菌污染。
若便器或标本盛器不洁而污染了变形杆菌，就可能影响病原菌的分离检出，甚至把污染菌误报造成误诊。
1．自然排便采集自然排便后，挑取其脓血或粘液部分2～3g，液状粪便取絮状物2～3ml, 置于灭菌容器内送检。
2．直肠拭子采集如不易获得粪便时，或排泄困难患者及婴儿，可用直肠拭子采取。
即用灭菌棉拭经生理盐水或甘油缓冲盐水湿润后，插入肛门内4～5cm(幼儿2～3cm)处，轻轻转动一圈拿出，插入灭菌试管内送检。
3．标本如不能立即送检，可将其保存于30％甘油缓冲盐水或专门运送培养基内。
【分离培养程序】自粪便中分离培养细菌需连续4d进行试验(图10-1)。
粪便或直肠拭子分离培养(SS、MAC)37℃、18～24h可疑菌落初步鉴定(双糖铁/尿素培养基)系列生化反应最终鉴定——血清学鉴定图10-1 粪便标本细菌学检查程序第1日：取粪便标本用SS平板作分区划线接种，37℃培养18～24h，观察菌落特征。
肠道致病菌不分解乳糖，所以在SS平板上生长的菌落为无色透明的小菌落。
如能产生H2S，则菌落中心呈黑色。
大肠杆菌在SS平板上一般不生长，但如粪便标本接种得多，大肠杆菌量多所以仍有少数生长。
大肠杆菌能发酵乳糖产酸，菌落呈红色，或菌落中心显红色，很容易和致病菌区分。
第2日：观察SS平板上菌落，用接种针挑取可疑菌落分别接种于双糖铁—半固体培养基中、尿素培养基，37℃培养18～24h观察结果。
第3日：观察半固体-双糖铁培养基结果。
如果双糖铁培养基中乳糖不发酵，可能为肠道致病菌。
根据葡萄糖发酵结果、运动力的有无等可初步判定为哪一类细菌。
最后鉴定该菌尚需自双糖铁培养基上取材做以下试验。
1．革兰染色。
2．接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖单糖发酵管，蛋白胨水及其他培养基37℃培养18～24h。
3．选用已知抗血清作玻片凝集试验。
第4日：表10-7 粪便中常见肠杆菌主要生化反应简明鉴定表双糖铁葡乳麦甘蔗吲甲V 枸尿橼上下硫动萄芽露基酸化层层氢力糖糖糖醇糖哚红P 盐素大肠杆菌＋⊕－＋⊕⊕⊕⊕ d ＋＋－－－产气杆菌＋⊕－＋⊕⊕⊕⊕＋－－＋＋－普通变形杆菌－⊕＋＋⊕－＋－＋＋＋－－＋伤寒沙门菌－＋＋＋＋－＋＋－－＋－－－甲型副伤寒沙门菌－⊕ d ＋⊕－⊕⊕－－＋－－－肖氏沙门菌－⊕＋＋⊕－⊕⊕－－＋－ d －希氏沙门菌－＋＋＋＋－＋＋－－＋－＋－痢疾志贺菌－＋－－＋－＋－ d d ＋－－－福氏志贺菌－＋－－＋－＋＋ d d ＋－－－鲍氏志贺菌－＋－－＋－＋＋－ d ＋－－－宋内志贺菌﹡＋－－＋﹡＋＋＋－＋－－－注：﹡：迟缓发酵；＋：产酸；⊕：产酸产气；－：不发酵；d：某些菌株阳性1．观察单糖发酵及其他培养基试验结果。