第25卷 第4期2003年7月北 京 林 业 大 学 学 报JOURNAL OF BEIJING FORES TRY UNIVERSITYVol.25,No.4Jul.,20032003 02 17收稿http: *国家自然科学基金(30170782)及国家林业局重点项目(9912)共同资助.作者简介:康向阳,男,1963年生,博士,教授.主要研究方向:林木倍性育种、细胞遗传学、生物技术.电话:01062338105 Email:kangxy@bj 地址:100083北京林业大学生物科学与技术学院.林木多倍体育种研究进展*康向阳(北京林业大学毛白杨研究所)摘要 该文综述了林木多倍体育种的途径、方法及其应用现状,指出多倍体育种在速生、优质、高抗逆性等林木新品种选育中具有更大的潜力;目前在林业生产中应用的多倍体新品种数量之所以相对较少,主要与树木细胞遗传等基础研究滞后、一些多倍体育种相关理论和技术难题未能得以攻克有关.而随着人类对其应用价值认识的提高以及有关新技术方法的注入,建立在现代遗传学以及细胞染色体工程技术基础之上的林木多倍体育种将焕发出新的生机与活力.关键词 林木,多倍体,育种中图分类号 S722 3+5Kang Xiangyang.Advances in researches on polyploid breeding of forest trees .Journal o f Beijing Fo restry University (2003)25(4)7074[Ch,56ref.]Institute of Populus tomentosa ,Beijing For.Univ.,100083,P.R.China.The paper overvie ws the research methods and application status of polyploid breeding in forest trees.It shows that polyploid breeding has great potentiality in selecting ne w varieties with traits of fast gro wing,high quality and resistance.However,the numbers of new polyploid varieties used in the forestry production are rel atively less.The main reasons are caused by the lag of basic researches in forest tree c ytogenetics,unresolved theoretic and technical problems related to the polyploid breeding.Following the increasing understanding on application values of polyploid and using of related ne w techniques,the polyploid breeding based on modern genetics and cell and chromosomal engineering will have ne w vitality and vigor.Key words forest tree,polyploid,breeding 染色体多倍化是植物进化最为重要的方式之一,其中约有30%~35%的被子植物经历过一次或数次多倍化事件形成多倍体[1].多倍体在自然界的广泛分布表明多倍化可以增强植物的适应性和竞争力,而人类也可以效法自然开展多倍体人工诱导及其利用工作.1935年,Nilsson_Ehle 在瑞典发现了一株叶片巨大、生长迅速的巨型三倍体欧洲山杨[2,3],引起了世界对多倍体应用价值的广泛关注,由此成为林木多倍体育种的开端.1937年,当Blakeslee 、Avery 采用曼陀罗等植物证实秋水仙素诱导植物多倍体的巨大效果之后,进一步掀起了世界性多倍体诱导研究的热潮,并获得了大量作物、果树、蔬菜、花卉等多倍体新品种[4 7].杨树、橡胶、桑树等一系列林木多倍体新品种的选育成功[8 16],为我们展示了日益广阔的发展前景.1 林木多倍体育种的作用植物细胞核内染色体组加倍以后,常常带来一些形态和生理上的变化,在提高生长速度、增进遗传品质以及提高目的代谢物含量等方面具有优势.就主要利用营养器官的林木多倍体育种而言,由于许多树种能够进行无性繁殖,可以不必担心多倍体育性差而导致繁殖困难的难题,而多年生习性又保证品种一旦育成就可以长期持续利用等,因此林木多倍体育种的潜力更大、作用更为突出.具体主要用于如下3个方面.1 1 纸浆材等短周期森林工业用材新品种选育多倍体特别是异源多倍体在染色体加倍后可带来营养器官的巨大性变化,通过多倍体育种培育更为速生、优质的林木品种,可以缩短栽培利用周期,提高工业利用价值.如欧洲山杨 美洲山杨杂种三倍体的材积生长比本地生长的山杨快1~2倍,纤维长度长18%,比重高20%,是一种优良的纸浆原料[9 11].我国三倍体毛白杨系列新品种的材积生长较相同立地条件下的二倍体提高2~3倍,采伐周期缩短至5年;而纤维平均长度在5年生时就达1.28 mm,比同龄普通毛白杨长52%,且长度分布均匀,长宽比大,纤维细胞壁薄,壁腔比小,尤其适合纸浆材生产[16,17].1 2 利用组织代谢产物的经济林木新品种选育由于多倍体的基因剂量倍增,从而使植物的一些生理生化过程随之加强,新陈代谢旺盛,其体内的某些生化成分的含量也相应提高.在林木育种中,多倍体育种可望使利用组织代谢产物的经济树种品质性状得到改善提高,如树木叶蛋白、橡胶以及黄酮等,从而提高林木的利用价值,降低生产成本.有关育种成果已经在生产中得到应用,其中四倍体橡胶树的产胶量比二倍体亲本提高34%[13];三倍体漆树的产漆量比二倍体高出1~2倍[18];三倍体桑树在产叶量和叶品质等方面均优于二倍体等[3,14,15].1 3 抗逆性生态防护型林木新品种选育多倍体植物一般生活力强,对环境适应性亦强,抗旱、抗寒以及抗病虫害等优势明显.仅从植物地理分布上看,多倍体大多出现在高纬度、高海拔以及北极、沙漠等气候环境变化剧烈的地区,说明植物多倍体比通常的二倍体具有更强适应不利自然条件的能力[1,4].通过多倍体育种可提高林木的抗逆性,相应扩大树种的栽培条件与种植范围.如四倍体柳杉的耐寒性增强[6];三倍体欧洲山杨比较耐干旱瘠薄,更适宜于条件较差的山地栽植,而且还表现出较强的抗病能力[6,9];三倍体桦木表现对锈病的抗性增强等[19].2 林木多倍体育种的途径与方法自然界植物多倍体的发生均来自于细胞核内染色体组的倍数变异,即体细胞分裂过程中偶然发生的染色体加倍以及减数分裂过程中产生未减数配子.当人类开始认识到多倍体的价值及其产生机制之后,伴随着科学与技术的进步,必然会进入人为创造与利用染色体倍性变异的阶段.2 1 从自然界中直接选择天然多倍体多倍体在林木中也是普遍存在的,现已检出天然多倍体的树种有挪威云杉、北美乔柏、日本柳杉、日本扁柏、落叶松、桤木、白桦、欧洲白蜡、欧洲水青冈、花椒、椴树、合欢、桑树、漆树、柳树、欧洲山杨,香脂杨、银白杨、美洲山杨、毛白杨等[2,6,18 25].这些天然多倍体大多表现不如二倍体,但在某些树种中也不乏表现突出的个体,如天然三倍体漆树具有生长快、产漆量高等特点.欧洲山杨、美洲山杨天然三倍体与相同立地条件下的同龄二倍体相比,在生长及材质等方面均显示出较强的优势[2,6].而在我国检出的5个毛白杨天然三倍体中,大多则是早已被林业生产实践所证明的优良类型(如易县毛白杨雌株)[25].显然对于一些存在天然三倍体的树种而言,直接从种群内选择即可收到较好的效果,但由于在林木种群中天然多倍体的出现毕竟仍占少数,限制性难题是如何将这些多倍体从其巨大的种群中鉴定出来.2 2 体细胞染色体加倍体细胞染色体加倍是人类最早选择获取多倍体的途径.有关研究表明,机械损伤、高温和低温、辐射、化学试剂等理化处理方法均可获得多倍体,其中以秋水仙素诱导效果最佳.在多倍体诱导过程中,应根据植物种的生物学特性、处理的材料及环境温度差异等,选取不同的处理方法和方式,掌握最佳处理时期,并适时调整处理剂量以及持续处理时间,可增进诱导效果[4 7].然而由于细胞分裂的不同步性,很难作到使所有的细胞染色体加倍,因此体细胞染色体加倍最终获得的大多是混倍体或嵌合体,影响了倍性优势的发挥.在林木中人工诱导获得的体细胞多倍体涉及杨树、桑树、橡胶、刺槐、桤木、桦木、相思、枸杞等树种[6,26 32],但迄今只有四倍体刺槐等少数几个品种在生产上成功应用,大多因生长等表现欠佳,主要用于作为育种和研究材料.其中值得提出的是在授粉后直接针对合子的染色体加倍,Einspahr 等(1965)将受精的美洲山杨雌花序浸在0 3%的秋水仙素溶液中处理24h,一次获得50株四倍体幼苗[32].该方法不但创造性地提高了多倍体诱导频率,而且更为重要的是由于处理仅涉及一个或数个细胞,避免了嵌合体的出现,可以获得真正的多倍体.2 3 不同倍性体间杂交当某树种中存在有可育的不同倍性体时,利用不同倍性体杂交是获取新的多倍体最为简捷而有效的途径.Nilsson_Ehle(1938)最早用三倍体欧洲山杨与二倍体进行杂交试验,获得了一些三倍体、四倍和71第4期康向阳:林木多倍体育种研究进展混倍体植株[33].此后的众多研究表明,利用三倍体与二倍体杂交之所以能够获得多倍体,是由于在三倍体不规则的减数分裂中可以产生少量不同倍性的可育配子的缘故.通过不同倍性体间杂交途径已成功获得多倍体的林木包括杨树、桑树、桦木、桤木、刺槐、枸杞等[6,10,11,34 36].Einspahr等(1984)、Weisgerber 等(1980)利用四倍体欧洲山杨与二倍体美洲山杨杂交获得了异源三倍体山杨,为杨树纸浆材等森林工业用材新品种选育做出了巨大贡献[10,11].在北欧和美国的有些地区,甚至将四倍体山杨雌株直接栽在优良的山杨林分中自由授粉,每年在四倍体上采种育苗、造林.目前,利用该途径的多倍体育种大多仅限于群体中存在天然多倍体或已经获得人工多倍体的树种,这主要是因为树木生长周期长,而人工多倍体诱导本身就是一个技术性较强的工作,即使培育成功,还要等待开花结实,需时较长;况且这种多倍体还必须具有较好的育性,在与另一亲本交配时应表现出较高的配合力等,否则或不能取得杂交后代,或虽有子代产生但无优势而言,使育种陷于劳而无功的失败境地.2 4 天然或人工未减数配子杂交直接利用天然未减数2n花粉进行多倍体育种的树种主要是杨树.国外在灰杨、香脂杨、黑杨杂种(Heidemj)等杨树中均发现有天然2n花粉,并用这些花粉进行授粉杂交得到了三倍体[6,36,37].朱之悌等(1995)利用毛白杨天然2n花粉与毛新杨、银腺杨杂交,最终获得了26株生长、材质俱优的异源三倍体,这些三倍体已经得到大面积推广应用,产生了巨大的经济、生态和社会效益[8,16].但并不是所有树种都会自然产生2n花粉,且2n花粉发生往往受树种自身遗传因素和外部环境的双重影响,具有偶然性、多变性,大多比率较低,因此其利用也就受到一定程度的限制.人工诱导花粉染色体加倍是树木人工多倍体育种中最为快捷的途径.Johnsson(1940)最早采用秋水仙碱处理欧洲山杨、美洲山杨雄花枝,取得了一些2n花粉,然后给雌花枝授粉,均得到了三倍体植株[38].此后在欧洲山杨、美洲山杨、美洲黑杨、香脂杨、银白杨、毛新杨、银腺杨、橡胶、桑树等树种中,均通过秋水仙素或高温等诱导方法进行了2n雌雄配子诱导,并与正常异性配子杂交得到了三倍体植株[39 49].其中,张志毅等(1992)应用秋水仙碱和高温等方法处理获得了毛新杨未减数2n花粉,并取得三倍体植株[43].康向阳等(1996)则在掌握杨树花粉母细胞减数分裂规律的基础上,明确了决定花粉染色体加倍效果的减数分裂有效处理时期;揭示了未减数2n花粉发育迟缓导致受精竞争能力差的原因;并证明了利用花粉倍性对辐射敏感性的差异增进2n 花粉参与受精竞争机率等,从而成功地建立了以细胞遗传学研究为基础,综合花粉染色体加倍、花粉辐射和杂交育种等技术,高效获得白杨杂种三倍体的育种技术体系,为三倍体大群体、强选择育种奠定了基础[8,44 48].有关研究表明,在进行人工诱导配子染色体加倍时,掌握树种的相关细胞遗传学知识可以取得事半功倍的效果.与利用2n花粉相比,由于利用2n雌配子不存在单倍性配子竞争问题,受精后可100%形成三倍体,因此采用2n雌配子选育三倍体更具诱惑力.其中,在树木中尚未见有关天然2n雌配子利用的研究.而在人工诱导2n雌配子方面,也仅在桑树与毛新杨等树种中有过尝试[40,49].与花粉染色体加倍相比,由于大孢子母细胞减数分裂进程不能即时观察,难以确定影响雌配子染色体加倍的减数分裂有效处理时期,因此,有关雌配子染色体加倍研究主要是通过对大批量材料的处理及筛选,工作量大,而三倍体得率却较低,且可重复性较差,从而限制了2n雌配子诱导及其育种应用.不言而喻,如能在利用2n雌配子相关机理和技术等方面取得突破,三倍体育种将会更为实用而有效.2 5 胚乳培养与细胞融合在大多被子植物中,一个精核与两个极核融合完成双受精过程,从而产生三倍性的胚乳,因此通过某一树种的胚乳培养也可以获得三倍体植株.1973年,Srivastava首次由罗氏核实木的成熟胚乳培养中获得了三倍体胚乳再生植株.此后胚乳培养研究进展迅速,其中有关林木胚乳培养的研究大多集中在经济树种中,主要在猕猴桃、枸杞、枣等胚乳培养方面取得三倍体苗木[50 53].目前胚乳培养的主要问题是由于愈伤组织继代培养中往往会产生染色体变异,从而造成再生植株多为非整倍体、混倍体,甚至恢复为二倍体等.相信该问题将会随着胚乳培养技术的进步而得到解决.细胞融合能够获得同源或异源三倍体、四倍体以及双二倍体,可以说是克服植物远缘杂交障碍、创造多倍体的又一条新途径.1960年,Cocking发明了用酶去除植物细胞壁获得原生质体的方法,为植物细胞杂交奠定了基础.此后,随着原生质体化学融合和电融合技术的发展,已有近百种内、种间和属间原生质体融合获得了再生植株,甚至可以实现体配细胞融合与再生[54 56].林木中的细胞融合主要集中于杨树等树种,且同其他植物一样,目前有关研究仍处72北 京 林 业 大 学 学 报第25卷于实验室探讨阶段,存在许多有待解决的理论与技术难题,但其所展示的广阔应用潜力是毋庸置疑的.3 展 望我国粮食问题解决的成功经验表明,未来环境以及木材供应问题的解决,以林木育种为核心的林业科学技术的创新和突破将起到决定性的作用.而从林木育种的整体研究现状来看,仍处于较低利用层次的选种、引种和杂交等常规育种阶段,林木育种要像农作物育种那样有一个飞跃性的变化,使材积等方面的增益得以进一步提高,依赖于常规育种的潜力是有限的,期望有较大的突破已比较困难,除非采用新的育种方法.在被寄予厚望的基因工程育种技术尚难在现代林木育种中有所作为的今天,只有综合倍性优势和杂交优势的多倍体育种可堪重任.据Leran(1945,1948)的经验,最适宜染色体加倍改良的作物应该是:染色体数目少;以收获营养体为主;异花授粉.此后De wey(1979)又附加二点,即多年生习性和营养繁殖,并认为由此减少作物对种子生产的依赖性,对多倍体育种成功有重要的意义[4].显然,许多林木树种均符合上述条件,然而迄今培育成功并在生产中得到应用的林木多倍体却为数不多,究其原因,主要与树木细胞遗传等基础研究滞后、一些相关理论和技术难题未能得以攻克有关.在这样的理论与技术基础背景下,育种的结果大多是因技术问题而知难而退;有的虽然诱导成功,但由于获得的多倍体个体数量较少,不能通过大群体、强选择育种提高遗传增益而浅尝辄止.显而易见,林木多倍体育种技术潜力的发挥程度,与多倍体育种相关的细胞遗传学研究以及多倍体育种理论和方法的完善、创新及推广应用最为关键,有关问题也必将逐渐引起更多的关注.随着世界森林资源紧缺的加剧,林木多倍体新品种将以其速生、优质以及高抗逆性等特性,在森林工业用材(如纸浆材等)生产和生态环境建设中得到重视,而现代生命科学技术的进步也必将逐一解决相关的限制性难题,使林木多倍体育种焕发出新的生机与活力.可以预见,建立在现代遗传学以及细胞染色体工程技术基础之上的林木多倍体育种,将随着人类对其应用价值认识的提高以及有关新技术方法的注入而全面步入实用化程度,从而带动未来林业的持续、高效发展.参考文献1 洪德元.植物细胞分类学.北京:科学出版社,19902 Nilsson_Ehle H.Note re garding the gigas form of Po pulus tremula foundin nature.Here ditas,1936(21):372 3823 Muntzing A.The 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