（生物科技行业）微生物饲
料添加剂
微生物饲料添加剂乳酸菌的微生物学检验
壹、概述

乳酸细菌是壹类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。乳酸细菌主要包括23个属，通常
在饲料中用作有益微生物的菌种有干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、植物乳杆菌
（Lactobacillusplantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）、粪肠球菌
(Enterococcusfaecium)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、俩歧双歧杆菌
(Bifidobacteriumbifidum)、屎肠球菌（Enterococcusfaecium）、乳酸乳杆菌
(LactococcusLactis)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。APT培养基通常用于分离绿色乳杆菌和其他乳
杆菌及肉食杆菌。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。
对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基，仍有利用磺胺二甲
恶唑、制大肠菌素和结晶紫等作为选择因子。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。此外
仍有如溴甲酚紫培养基、CHALMERS培养基等也常用于乳酸菌的分离。
以下举几个例子来说明乳酸菌的作用及特性。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属（Lactobacillus）
的壹个种。其特性为：杆菌，俩端圆，不运动，无鞭毛，接触酶阴性，和苦杏仁苷、纤维二
糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、水杨苷、蔗糖反应为阴性，
阿拉伯糖、葡糖酸盐、甘露醇、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨糖、木糖反应为阴性。由于嗜
酸乳杆菌在生长中能够产生壹些抑菌物质，如有机酸、细菌素及类细菌素，能够抑制肠道中
有害微生物生长繁殖，起到平衡肠道菌群的作用。且能产生B族维生素，包括各种叶酸、生
物素、维生素B6和维生素K等，分泌各种有益物质，如乳酸、乙酸等，降低肠道pH值。
粪肠球菌主要存在于人类或动物肠道，是人类和动物肠道的正常菌群等。粪肠球菌为革兰氏
阳性，圆形或椭圆形，能在胆汁七叶苷琼脂上生长，不产生色素。乳酸片球菌细胞呈球状，
直径0.6~1.0μm，在直角俩个平面交替形成四联状，壹般细胞成对生，单生者罕见，不成链
状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺
线的生长物呈丝状，接触酶阴性，不产细胞色素，在不加啤酒花的麦芽汁中生长，能利用半
乳糖、阿拉伯糖、木糖和海藻糖产酸，不分解蛋白质，不产吲哚，不水解马尿酸盐。某些菌
株能利用蔗糖和乳糖产微量的酸。不能利用麦芽糖、甘露醇、糊精等产酸，能产丁二酮。
二、检测方法
1范围
本方法规定了微生物饲料中各乳酸菌(包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球
菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、戊糖片球菌)及其总数的测定及鉴定方法。
本方法适用于微生物饲料中乳酸菌的检测。
2术语：
乳酸菌：壹群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢
酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。
乳酸菌菌数总数：试料在壹定条件下培养后，所得1mL试料中所含乳酸菌菌落的总数。
3设备和材料
3.1恒温培养箱：36±1℃。
3.2冰箱：0~4℃。
3.3恒温水浴：46±1℃
3.4电炉：可调式。
3.5吸管：容量为1、10、25mL。
3.6广口瓶或三角瓶：容量为500mL。
3.7平皿：直径为9cm。
3.8试管：18×180mm。
3.9显微镜。
3.10高压灭菌锅。
3.11烘箱。
4培养基和试剂
4.1改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）。
4.2改良MC培养基（ModifiedChalmers培养基）。
4.30.1%美兰牛乳培养基。
4.46.5%氯化钠肉汤。
4.5pH9.6葡萄糖肉汤。
4.640%胆汁肉汤。
4.7淀粉水解培养基。
4.8精氨酸水解培养基。
4.9乳酸杆菌糖发酵管。
4.10七叶苷培养基。
4.11革兰氏染色液。
4.123%过氧化氢溶液。
4.13蛋白胨水、靛基质试剂。
4.14明胶培养基。
4.15硝酸盐培养基、硝酸盐试剂。
4.16生理盐水：将蒸馏水加入8.5g的食盐中做成1000mL的溶液。在121℃下灭菌15min。
5乳酸菌菌落总数的测定
5.1检验程序
乳酸菌菌落总数检验程序如下：
图：乳酸菌检测程序图
5.2操作步骤
5.2.1以无菌操作将经过充分摇匀的试料25mL（或25g）放入含有225mL灭菌生理盐水的
灭菌广口瓶内作成1:10的均匀稀释液。
5.2.2用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试
管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。
5.2.3另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增壹次，即换
用1支1mL灭菌吸管。
5.2.4选择2~3个之上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的
吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作俩个平皿。
5.2.5稀释液移入平皿后，应即时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC）
注入平皿约15mL，且转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液
试料用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，之上整个操作自培养物加入培养皿开始至
接种结束须在20min内完成。
5.2.6待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃恒温培养箱内培养72±1h取出，观察乳酸菌菌
落特征（见表1），选取菌落数在30~300之间的平板进行计数。
5.3乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。

试料
表1乳酸菌菌落特征
改良TJA 改良MC
杆菌 平皿底为黄色，菌落中等大小，微白色，湿润，边缘不整齐，直径3±1mm，如棉絮团状菌落。 平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，
边缘似星状，直径2±1mm，可有淡淡的晕。
球菌 平皿底为黄色，菌落光滑，湿润，微白色，边缘整齐。 平板底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，
边缘整齐，可有淡淡的晕。
注：干酪乳杆菌在改良TJA培养基上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状，

6乳酸菌的鉴定

进行革兰氏染色，显微镜检查，且做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，
无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定，则作以下试验。
6.1菌种制备：自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36±1℃，24~48h
培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。
6.2乳酸杆菌鉴定试验：极少见仍原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。
6.3几种乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。
6.4肠球菌的鉴别试验，见表3。
6.5肠球菌属和片球菌属容易混淆，其鉴别可见表4。
表2常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应
七叶苷 纤维二糖 麦芽糖 甘露醇 水杨苷 山梨醇 棉籽糖 蔗糖
干酪乳杆菌 + + d + + + - d
嗜酸乳杆菌 + + + - + - d +
植物乳杆菌 + + + + + + + +
注：d──有些菌株阳性，有些菌株阴性；#──弱、慢或阴性。

表3肠球菌的鉴别表
名称 α-半乳糖苷酶 L-阿拉伯糖 甘露醇 蜜二糖 山梨醇 丙酮酸发酵
粪肠球菌 - - + - D+ +
屎肠球菌 V V V V D- -
注：D+，通常阳性；D-，通常阴性；V，不同或可变。

表4链球属和片球菌属的鉴别特征
链球菌属 片球菌属
细胞形态 球或卵圆形 球形
排列 成对，链 四联，成对
接触酶 - d
厌氧条件下生长良好 + +
从葡萄糖产气 - -
抗万古霉素 - +
注：d──有些菌株阳性，有些菌株阴性。

7结果计算及表述

7.1乳酸菌总数
菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸
菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。
7.2各乳酸菌数
菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定，根据证实为某乳酸菌菌落计算出该皿内的此乳酸
菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中此乳酸菌数。如含有屎肠球菌的试料中10-6稀释
液在改良TJA琼脂平板上，生成的屎肠球菌可疑菌落为100个，取5个鉴定，证实为屎肠球
菌的是4个，由1克试料中含屎肠球菌数为：。.