④理论上讲，除少数基因外，一个基因组含 有不同基因数量生物或许是延续物种的 一种办法。
(四)PCR技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，即PCR技术，是一种在体外快速 扩增特定基因或DNA的方法，故又称为基因的 体外扩增法。

2．不同丰度mRNA的cDNA克隆 在许多组织和 细胞中，各种mRNA的含量都是极不相同的。 其中，有些类型的mRNA含量十分丰富，每个 细胞可拥有数干个拷贝，而有些类型的mRNA 每个细胞只有少数几个拷贝。
Байду номын сангаас
对于稀少mRNA，可以通过蔗糖梯度离心及变 性条件下的凝胶电泳，分离以后富集。也可 以根据已知核酸序列，合成互补的核苷酸序 列，在Ploy(A)RNA的逆转录反应中，这些寡 核苷～40个核苷（四）代表性差异分析技术

代表性差异分析技术原理 试验对象 (tester,T)和供试探针(driver，D)在接受差 异分析前，均用一种识别4碱基序列的限制性 内切酶做切割处理，形成平均长度为256bp的 DNA片段代表群，保证绝大多数遗传信息能被 PCR扩增。第一次T与D杂交反应时两者总量比 为1∶100，第二次增加到1∶400，第三次则 为1∶80000，T群体相非特异性序列几乎没有 偶然逃脱的可能。另外，T减D反应后仅设臵 了72℃复性与延伸和95℃变性这两个参数， 共20个循环，从而使PCR产物的特异性及所得 的探针纯度均大为提高。
(二)反向生物学法

原理 已知蛋白质序列可以根据它的密码一 些蛋白质的核苷酸编码序列，在其进化的过 程中保持着高度的保守性，这样就使核酸体载体发展而来的原核表达载体。 表达的蛋白质以融合蛋白质形式合成，不易 被原核细胞中的有关的蛋白酶消化降解，可 以得到较高的表达水平。
(三)差异显示技术


差异显示技术可以从一对细胞群体或一对基 因型各自产生的约15万种mRNA中，有效地鉴 定并分离出差异表达的基因。 差异显示技术的原理 其原理是以一类与 mRNA的plyA结合的寡核苷酸序列作为锚定引 物，进行逆转录，形成mRNA－DNA杂交分子。 再加入另一短的随机序列l0聚体作为引物， 进行PCR反应，然后用聚丙烯酰胺凝胶显示扩 增片段。
三、表性克隆法
(一)差异杂交 差异杂交又叫差异筛选。它特别适用于分离 在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因 以及受生长因子调节的基因，亦可有效地分 离经特殊处理诱导表达的基因。

1．差异杂交原理 差异杂交的技术只需要拥有两种 不同的细胞群体，在一个细胞群体中目的基因正常 表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。这样 两种不同细胞群体的DNA提取物中，一个群体含有一 定比例的目的基因DNA。另一个群体不含有。因此， 以这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针，分 别为探针时，所 有包含着重组体的菌落都呈阳性反应；而以目的基 因不表达的DNA群体为探针时，除了含有目的基因的 菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应。比较这两 种结果并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的 菌落。
2．差异杂交技术的局限性 差异杂交的 灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度 的mRNA。这是因为在差异杂交中所使用 的杂交探针，仅有极少的一部分能与目 的基因核苷酸序列完全互补，所以那些 低丰度的DNA很难用此法检测出来。另外， 差异杂交需要筛选大量的杂交膜，鉴定 大量的噬菌斑，因此十分耗时费力。
（二）衰减杂交技术
3．cDNA克隆特点 ①cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒， 例如流感病毒，cDNA克隆就成基因所含的克隆数，要比一个完全的基因组文 库所含的克隆数少得多。理论所必需的最低克隆数， 约为1.7×105个克隆。 ③如果某一特定的基因克隆，目的在于获得一种特殊 的真核蛋白质产物，涉及它的蛋白质的检测，则必 须用当的载体连接，形成重组体分子， 转化大肠杆菌细胞，经过生长扩增之后速地增殖。插 入的外源DNA在大小及序列上的差异，将影响 就可能增加，而有些重组体的比例则可 能下降，甚至会丢失。



②用已知探针筛选出阳性克隆，并不一定是 单一的完整的目的基因。由于DNA片段是随机 的，可能酶切到基因的一部分；或者基因很 大，载体容量不够，很可能被漏掉；或者靶 基因两端有一些其他序列，尤其是大容量载 体库，更容易产生此结果。 ③如控使总 Ploy(A)mRNA转变成双链cDNA群体，并插入到适当 的载体分子，然后再转化到大肠杆菌寄主菌株的细 胞内，如此便构成 library)。 广泛使用的一种方法是，先用逆转录酶合成一条 cDNA链，经碱降解作用，再用大肠杆菌DNA聚合酶I 合成第二条链，最后用单链特性S1核酸酶消化掉 cDNA单链部分，形成双链的cDNA，与载体连接后， 转化宿主细胞，产生千万个克隆，即为cDNA。四、插入分离法
此类技术多用于植物基因分离。 当一段特定的DNA序列插入到植物基因组中目的基因 的内部或其邻近位点时，使会诱发该基因发生突变， 并最终导致表型变化，形成突变体植株。用此DNA作 为杂因NA序列相当于在植物 基因上贴了一张标签，因此DNA插入突变分离基因的 技术，又叫做DNA标签法。主要包括转座子标签法和 T－D来自物体NA，根据建库所用载体容量大 小制备适宜的DNA片段。应注意的是，分离的 DNA片段最小应为载体容量的2倍以上。
(一)化学合成法

化学合成法关键是：①最好在基因两个末端 设有不同酶切位点，以便与载体进行有方向 性的连接。②合成的片段应该经过适当纯化， 一般以PAGE或HPLC纯化较好，因为合成过程 中有些片段不完整，必须除去。③片段5’端 不宜过长，因为越长，成本越高，产量越低， 而且出现错误的几率越大。⑤连接时，应每 四个两两互补片断一同连接，然后每两组相 连，最后和载体连接。⑥转化克隆后，必须 分析序列，予以确证。
第二节 转基因技术

动物转基因技术 植物转基因技术 微生物转基因技术 报告基因和选择标记
一、动物转基因技术




将外源DNA导入哺乳动物细胞的方法原则上可大致分 为三类：生物方法、物理学方法和化学方法。 在化学方法中最常用的有磷酸钙沉淀法、DEAE葡聚 糖转化法和脂质体转化法。 在物理方法中，有电穿孔法，还有其他用于较为特 殊的情况下的方法，如基因枪轰击法、受体介导的 基因导入法等。 在生物方法中，目前主要是把病毒作为外源DNA导入 的工具，通过病毒感染将外源DNA导入细胞中。这种 方法的优点在于它具有较高的转化效率，并能在一 定的条件下实现对特定细胞的靶向性，目前主要用 于基因治疗的研究中。

衰减杂交原理 衰减杂交的本质是除去那些共同存 在的cDNA序列，使欲分离的目的基因的序列得到有 效的富集，提高分离的敏感性。从表达目的基因的 组织(记作＋)提取mRNA逆转录为cDNA，然后与无目 的基因表达的组织(记作－)提取的mRNA做过量杂交， 在＋组织与－组织中均表达的基因产物形成cDNA／ mRNA双链杂交分子，而特异mRNA逆转录的cDNA仍保 持单链状态，将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱， DNA－DNA杂交分子便结合在柱上，而游离的单链 cDNA则过柱流出。
第七章 基因克隆策略与转基因技术
一
基因克隆策略
二
转基因技术

基因克隆和转化技术是基因工程操作的主要 组成部分，没有克隆就无法开展基因工程， 没有简单有效的转化技术就难以实现外源基 因的遗传重组。随着分子生物学技术和相关 学科的发展，基因克隆和转化的新技术、新 方法不断涌现。因此，有必要进一步了解这 些技术方法的原理、操作和优缺点及其对因 材选法，提高基因克隆和转基因效率的意义。
二、功能克隆法
(一)双抗体法 早期人们克隆目的基因采用一种双抗体技术。由于 抗体的特异性，它只对特种抗原产生反应，可以用 已知蛋白质免疫制造特异性抗体。用此抗体与特定 细胞的胞质进行反应。因为细胞中不断在核糖体与 mRNA复合体上翻译出长短不一的靶蛋白，这些蛋白 与复合体一起与特异性抗体产生反应，结合在一起。 然后再用抗体与它们反应，生成更大的颗粒。通过 超速离心即能使其从细胞质中分离出来。最后用蛋 白酶降解蛋白质，可以得到特异的mRNA，以01igodT 为引物，逆转录合成cDNA经克隆即可得到目的基因。
第一节 基因克隆策略
一、一般克隆法 (一)化学合成法 一般方法是先将寡核苷酸激活，带上5’磷酸基团， 然后再与相应的互补的寡核苷酸片段退火，形成带 有黏性末端的双链寡核苷酸片段。把这些双链寡核 苷酸片段混合在一个试管中，加上T4DNA连接酶，使 它们彼此连接组装成一个完整的基因或基因的一个 片段。这些组装的产物被插入到适当的载体上，并 转化大肠杆菌寄主细胞。最后DNA序列分析所组装的 基因。应用这种基因组装法，已经克隆出了多种基 因，其中包括分子量较大的α干扰素和组织纤溶酶 原激活因子(tpA)等多个基因。
一、动物转基因技术

根据不同的实验目的，外源DNA导入哺乳动物细胞又 可分为瞬时转化和稳定转化。 瞬时转化一般是外源DNA导入细胞1～4d后收获转化 细胞，对转化基因的转录和复制进行分析。 稳定转化则需要使外源基因整合于细胞染色体，从 而得到稳定的转化细胞株。


一、动物转基因技术

1．磷酸钙沉淀法 如果核酸和磷酸钙以共沉淀物颗粒形式存在，细胞 将显著增加其摄取核酸的能力，这一现象是磷酸钙 转化方法的基础。磷酸钙转化中要用较高浓度的 DNA(10～50μg)。

④在已知基因组DNA序列酌情况下，通过同cDNA序列 的比较，还可以确定出内含子和外显子之间的界线。 另外，cDNA片段小，序列分析方便。 ⑤在发育过程中时间调节基因表达特征的分析，以及 组织特异性基因表达特性的分析，都要使用cDNA克 隆。 ⑥鉴定出在某种类型细胞中存在，而在同种类型细胞 不同处理中又不存在的mDNA分子的cDNA克隆，如差 异显示等。 ⑦用cDNA制成表达芯片很容易进行基因表达分析。