农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。

2.MS min母液(100×)KI 0.083gH3BO30.62gMnSO4∙4H2O 2.23g 或MnSO4∙ H2O 1.69gZnSO4∙7H2O 0.86gNa2MoO4∙ 2H2O 0.025gCuSO4∙ 5H2O 0.0025gCoCl2∙ 6H2O 0.0025g注意：Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合。

加dH2O定容到1000ml室温保存。

3.N6max母液(10×)KNO328.3gKH2PO4 4.0g(NH4)2SO4 4.63gMgSO4∙ 7H2O 1.85gCaCl2∙ 2H2O 1.66g 或CaCl2 1.25g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。

4.N6 min母液(100×)KI 0.08gH3BO30.16gMnSO4∙ 4H2O 0.44g 或MnSO4 ∙ H2O 0.3335gZnSO4∙ 7H2O 0.15g加dH2O定容到1000ml室温保存。

5.Fe2+-EDTA(100×)取一个烧杯加300ml dH2O以及FeSO4∙ 7H2O 2.78g；在另一个烧杯中也加300ml dH2O加热到70℃后加入Na2 EDTA ∙ 2H2O 3.73g；待到两种药品都溶解了，混合，70℃保温2hr，然后加dH2O定容到1L，4℃保存。

6.维生素(100×)Nicotinic acid 0.1gPyridoxine HCl (VB6) 0.1gThiamine HCl (VB1) 0.1gGlycine 0.2gInositol 10g加dH2O定容到1000ml 4℃保存。

7.AA max母液(10×)KCl 29.50gNaH2PO4 1.50g 或NaH2PO4 ∙ 2H2O 1.95gMgSO4· 7H2O 2.50gCaCl2∙ 2H2O 1.50g 或CaCl2 1.13g加dH2O定容到1000ml室温保存。

8.AA min母液(1000×)MnSO4∙ H2O 1.0gH3BO30.3gZnSO4∙ 7H2O 0.2gKI 0.075gNaMoO4∙ 2H2O 0.025gCuSO4∙ 5H2O 0.0025gCoCl2∙ 6H2O 0.0025gNa2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合，加dH2O定容到1000ml室温保存。

9.2,4-D母液(1mg/ml)2,4-D 100 mg先加1.0 ml 1N KOH 摇5min，然后加10ml H2O 继续摇直到2,4-D溶解，加水定容到100 ml室温保存。

10.6-BA母液(1mg/ml)6-BA 100mg加1.0 ml 1N KOH摇直到6-BA溶解，加水定容到100 ml室温保存。

11.N AA母液(1mg/ml)NAA 100mg加1.0ml 1N KOH 并搅动直到NAA溶解，加水定容到100 ml室温保存。

12.I AA母液(1mg/ml)IAA 100mg加1.0 ml 1N KOH摇直到IAA溶解，加水定容到100 ml室温保存。

13.100mM AS母液(1mg/ml)AS 0.196gDMSO 10ml分装到1.5 ml离心管4℃保存。

14.1N KOH母液(1mg/ml)KOH 5.6g用100ml H2O溶解后室温保存。

15.羧苄青霉素2钠(CN) （200mg/ml）CN干粉1g用5ml灭菌dH2O溶解后，分装到1.5ml Tub中（无菌操作）。

或者用5ml 75％酒精溶解，分装到1.5ml Tub中（无菌操作）。

16.A stock solution （继代A）:硝酸铵16.5g硝酸钾19.0g磷酸二氢钾 1.7g七水硫酸镁 3.5g二水氯化钙4g/无水氯化钙3g加水依次溶解，定容1000ml，室温保存17.B stock solution （继代B）:四水硫酸锰 5.0g硼酸 1.5g七水硫酸锌 2.0g碘化钾0.75g （未完）二水钼酸钠0.25g五水硫酸铜0.0389g六水氯化钴0.025g加水依次溶解，定容1000ml，室温保存（二水钼酸钠单独称，单独溶，缓慢加入，边加边搅）三．农杆菌介导的水稻愈伤的遗传转化过程1 愈伤诱导1)成熟种子脱壳后70%酒精灭菌1min，0.15% HgCl2处理15min；2)灭菌单蒸水洗5-7次；3)将种子接种到诱导培养基上，每瓶接6-8粒；4)置黑暗中26±1℃处理约4-7周。

2 愈伤继代挑取浅黄、致密且相对较干的胚性愈伤接种到继代培养基上26±1℃处理2周，不可接太多。

3 预培养挑取致密且相对较干的胚性愈伤接种到预培养基上置黑暗中3至4天。

4 农杆菌准备准备浸染的农杆菌扩大培养。

在相应抗性平皿中涂菌，28度培养箱中培养2－3天5 农杆菌悬浮培养准备将农杆菌转移（粳稻：用接种环刮入半环-1环菌，籼稻：3环-4环菌）到100ml悬浮培养基中28℃摇瓶培养30-60min。

6 农杆菌侵染（共培养）1)经过预培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；2)调整农杆菌悬浮液的OD600值到0.8-1.0之间；3)用农杆菌悬浮液浸泡愈伤20－30min；4)倒去菌液，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min；5)愈伤放在灭菌的滤纸上晾干后，转移到共培养培养基上去。

培养物19-20℃黑暗处理2天。

7 水洗和筛选1)经过共培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；2)用灭菌单蒸水洗5至7次愈伤；3)用含有400ppm Cn（羧苄青霉素二钠）的灭菌水浸泡愈伤30min（封好口后，可于28度，180至200RPM摇20－30min）；4)倒去含抗生素的灭菌水，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min；5)在灭菌的滤纸上晾干愈伤；6)转移愈伤到相应抗性的筛选培养基筛选2-3个循环（每个循环约2周）8 预分化与分化1)经过筛选得到的抗性愈伤转到带抗性的预分化培养基的培养皿中，黑暗处理5-7天；2)经过预分化的愈伤转移到100ml三角瓶里的分化培养基中，每瓶3粒愈伤，只选亮黄色的抗性愈伤，不必接入太多。

；3)26℃光照处理，约需40－60天。

9 生根1)从分化瓶中挑出要做生根的苗子，同一块愈伤所得的苗子只选一棵；2)剪掉所有原有的根，注意不要剪掉分生组织；3)将苗子转入生根培养基，28℃光照处理7至10天。

10 移栽移去生根管的封口膜，倒入约1cm深的自来水，在光照培养室炼苗3－4天，移栽至准备好的栽种处。

四．培养基注意：所有的培养基必须现配现用。

（一）粳稻的转化1.诱导培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 100mlN6min母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液(100×) 10mlVitamin母液(100×) 10ml2,4-D母液 2.5ml脯氨酸0.3g水解酪蛋白0.6g蔗糖30gPhytagel 3g加H2O 600-700ml并用KOH调节pH到5.9，煮沸后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口灭菌。

2.继代培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 100mlN6min母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液(100×) 10mlVitamin母液(100×) 10ml2,4-D母液 2.0ml脯氨酸0.5g水解酪蛋白0.6g蔗糖30gPhytagel 3g加H2O 900ml并用1N KOH调节pH到5.9，煮开后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口灭菌。

3.预培养培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 12.5mlN6min母液(100×) 1.25mlFe2-EDTA母液(100×) 2.5mlVitamin母液(100×) 2.5ml2,4-D母液0.75ml水解酪蛋白0.15g蔗糖5g琼脂粉 1.75g加H2O 250ml并用1N KOH调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。

使用前，煮溶培养基，加入5ml葡萄糖母液（灭菌的50%葡萄糖溶液）和250μl AS 母液，然后分装到培养皿中（25ml/皿）。

4.共培养培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 12.5mlN6min母液(100×) 1.25mlFe2-EDTA母液(100×) 2.5mlVitamin母液(100×) 2.5ml2,4-D母液0.75ml水解酪蛋白0.2g蔗糖5g琼脂粉 1.75g加H2O 250ml并调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。