动物用狂犬病疫苗研究进展朱武洋粱国栋

【摘要Ｊ狂犬病是一种自然疫源性疾病，狂犬病病毒宿主动物的免疫状况对于预防和控制人类狂犬病的流行至关重要。随着分子生物学和免疫学的发展，动物用狂犬病疫苗，尤其是基因工程疫苗的研究取得了巨大的进展。本文将就动物用狂犬病疫苗的研究进展与应用状况作一综述。【关键词】狂犬病；疫苗

狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）是由狂犬病病毒（ＲａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ，

ＲＶ）侵犯中枢神经系统（ＣｅｎｔｒａｌＮｅｕｒａｌＳｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）引起的人兽共患致死性脑脊髓炎，死亡率为１００％…。该病是一种自然疫源性疾病，狂犬病病毒的动物宿主包括犬只、猫等家养动物，也包括臭鼬、浣熊等多种野生动物。ＲＶ可在宿主动物之间传播与蓄积，而人类是该病毒的终末宿主。狂犬病潜伏期较长，且目前尚无有效的狂犬病治疗方法，因此疫苗是预防和控制狂犬病的有效手段，在人类与狂犬病斗争的１００多年中，疫苗对防治狂犬病发挥了重要的作用。动物用狂犬病疫苗可阻抑狂犬病病毒在其宿主动物间的播散，从理论上可截断人类狂犬病流行的传染源和传播途径。因此，加强动物狂犬病疫苗研究，研制一种安全、有效、廉价的动物用狂犬病疫苗，进而提高动物狂犬病免疫覆盖率，对于积极主动地预防和控制人类狂犬病流行意义重大。本文针对动物用狂犬病疫苗的研究进展，尤其是基因工程狂犬病疫苗的最新研究进展加以综述。１动物用狂犬病疫苗概况动物用狂犬病疫苗主要有三种，即灭活疫苗、弱毒苗和基因工程疫苗。动物用灭活苗安全、有效，但一次免疫用量较大，且价格昂贵，不适合于发展中国家，而狂犬病则主要在这些地区流行。与之相比，利用组织培养方法获得的减毒活疫苗主要用于发展中国家家养动物的免疫，是应用最广泛的动物用狂犬病疫苗。动物用减毒活疫苗主要是以狂犬病病毒Ｆｌｕｒｙ株和ＥＲＡ株为基础发展起来的。１．１Ｆｌｕｒｙ株为基础的弱毒苗制所ＤＩＯ：１０．３７０６１ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４０９２．２００９．０３．００４作者单位：１０００５２北京中国疾病预防控制中心病毒病预防控Ｆｌｕｒｙ株狂犬病病毒是由Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ等于１９４０年从狂犬病患者脑内分离到的街毒。为便于区别，

在鸡胚内传６８代以前的Ｆｌｕｒｙ株病毒称ＬＥＰ株（鸡胚低代株），高于１３６代的称ＨＥＰ株（鸡胚高代株）幢１。４０－－５０代ＬＥＰ株对犬只不致病的同时，仍保持较高的免疫原性。用ＬＥＰ株活毒以肌肉注射的方式接种犬只一次，其免疫力可保持３年，但ＬＥＰ株活疫苗还具有较强的致病性，使用ＬＥＰ株活疫苗免疫动物时，曾因毒力太强而使牛发生麻痹。ＨＥＰ株病毒脑内接种成年小鼠、家兔和狗时，已完全丧失致病力，但脑内接种后可感染乳鼠及猴。１．２ＥＲＡ株为基础的弱毒苗ＥＲＡ株狂犬病病毒是１９５３年从狗脑中分离到的街毒，因由Ｅ．ＧａｙｎｏｒＲｏｃｈｉｔｎｉｅｈｉ

Ａｂｅｌｓｅｆｈ所研

究，故定名为ＥＲＡ。该毒株又称亚拉巴马流窜犬毒（Ｓｔｒｅｅｔ，ＡｌａｂａｍａＤｕｆｆｅｒｉｎ），经地鼠肾细胞、鸡胚、牛肾和猪肾细胞培养并制成疫苗，疫苗株简称ＳＡＤ。以ＥＲＡ株为基础筛选的＆∞．Ｂｅｒｎ、ＳＡＧｌ、ＳＡＧ２、

ＳＡＤＢｌ９等疫苗株可刺激较强的粘膜免疫，适合于口服免疫。而狂犬病病毒主要宿主动物是犬只等家养动物以及野生动物，口服免疫预防是建立狂犬病免疫动物群最为可行的办法之一。因此，与Ｆｌｕｒｙ株为基础的弱毒疫苗相比，ＥＲＡ株为基础的狂犬病疫苗的研究更为广泛和透彻。１．３我国生产的弱毒苗１９８３年中国兽药监察所从国外引进ＥＲＡ毒

株，并证明该毒株对黄牛、山羊、绵羊、家兔及犬只等没有致病性。以该毒株为基础制备的活毒疫苗可用于马、牛、羊和家犬的免疫ｂＪ。ＣＴＮ株狂犬病病毒

是分离自我国山东的一株狂犬病街毒，ＣＴＮ—ｌ株是中国科学家经鼠脑传代后固定ＣＴＮ病毒后得到的二倍体细胞适应株，以４．０ｍＬ滴度大于６．０ＬＤ５０的该株病毒口服免疫４月龄以上家犬，１个月后产

万方数据垦堕塑耋堂盘查！！！！生！旦箜！！鲞筮ｉ塑！坐！翌！！鱼！型』！！翌！！丛∑ｉ翌！！ｇ￥！！！堡；！！！！坠！！鱼！丛！：！生抗体，６个月为１０４，１５个月为３４，抗体阳转率＞８０％；口服后２４、２８和７２小时，家犬口腔内未分离到病毒，表明该疫苗株安全性良好Ｈ］。ＳＲＶ９株是侯世宽等１９９５年以ＳＡＤＢｌ９为基础，通过空斑克隆和小鼠接种试验筛选获得的弱毒疫苗株，该毒株是ＳＡＤＢｌ９的中等蚀斑株，无致病性、口服免疫小鼠的保护率达１００％，而亲本株仅为２５％～３０％，不同免疫剂量对断乳和成年小鼠脑内、肌肉、皮下和口服途径接种均安全，并产生良好的免疫反应，明显优于亲本株＆ｍＢｌ９。将该疫苗株制成诱饵疫苗后，免疫１０００条犬，抗体均达到免疫保护水平Ｈ３｜。减毒活疫苗为有效地预防和控制狂犬病流行，尤其在发展中国家的流行起到了重要的作用，但减毒活苗存在回复感染的可能，有一定的安全隐患，与之相比，利用基因重组技术制备的基因工程狂犬病疫苗在保持良好免疫效果的同时，有可能解决目前狂犬病疫苗存在的安全性问题。２基因工程疫苗随着分子生物学、免疫学及狂犬病致病机理研究的深入，与传统的减毒活疫苗一样，基因工程手段已经成为获得狂犬病疫苗的重要途径，利用基因工程技术来排除狂犬病病毒固有毒性成份而保留其完整的免疫原性可望获取高效、安全和经济的动物用疫苗。２．１基因工程重组疫苗国内外对于狂犬病基因工程重组疫苗进行了深入的研究，并在预防控制狂犬病流行中发挥了一定的作用。糖蛋白和核蛋白是狂犬病病毒最主要的两个抗原蛋白，采用基因工程手段在病毒载体中表达糖蛋白基因和核蛋白基因，即可制备糖蛋白和核蛋白亚单位疫苗。２．１．１糖蛋白亚单位疫苗２．１．１．１基于痘病毒载体的糖蛋白亚单位疫苗１９８１年美国Ｗｉｓｔａｒ研究所首先克隆了ＥＲＡ株糖蛋白，并对该蛋白的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析，从而揭开了研制狂犬病基因工程重组疫苗的序幕［６］。１９８３年Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ等设计了不同长度糖蛋白的编码序列，并构建了相应的原核表达载体，转化大肠杆菌后表达出多种抗原蛋白，这些基因工程多肽虽然都不同程度与野生糖蛋白抗血清发生反应，但原核表达系统对蛋白的合成、折叠、糖基化等生物学过程有一定的影响，这些多肽结合糖蛋白抗体的能力仅为野生糖蛋白的２～３％，且免疫原性差‘７１。禽痘病毒属成员在哺乳动物体内仅发生流产性感染，但其重组体却能表达外源基因诱发保护性免疫应答而不形成感染性病毒颗粒，显示出作为载体的独特优越性。Ｃａｄｏｚ等旧１和Ｆｒｉｅｓ等旧１分别以金丝雀痘病毒为载体构建了糖蛋白的重组病毒，Ｉ期临床观察表明该重组病毒具有良好的安全性及免疫效果。１９９１年Ｔａｙｌｏｒ等也在金丝雀痘病毒中表达了狂犬病病毒ＥＲＡ株的糖蛋白基因，制备的ｖＣＰｌ６重组病毒疫苗与禽痘狂犬病重组疫苗（ｖＦＰ６）相比较，ｖＣＰｌ６在小鼠中产生的保护力较ｖＦＰ６高１００倍，而且重组糖蛋白金丝雀痘病毒在非鸟类不繁殖，但能表达糖蛋ｃａＩｔ０］，故该类糖蛋白亚单位疫苗，与痘病毒和腺病毒重组疫苗相比，具有较好抗原性和免疫保护作用的同时，其安全性也更好。２．１．１．２基于腺病毒载体的糖蛋白亚单位疫苗除痘病毒载体外，腺病毒载体也是制备狂犬病重组疫苗的常用载体。１９９０年Ｐｒｅｖｅｃ等将ＥＲＡ株糖蛋白重组于人腺病毒５型中，得到了表达狂犬病病毒糖蛋白的重组病毒ＡｄＲＧｌ，该株病毒可有效地表达狂犬病病毒糖蛋白，诱导高水平的免疫反应，并可应用于不同种属的动物¨１｜。以腺病毒为载体构建表达狂犬病高致病毒株ＣＶＳＮ２Ｃ糖蛋白基因的重组疫苗候选株ｒＡｄＧＰｃｖｓ和ｒＡｄＧＰｃｖｓ’免疫小鼠后的保护率可达７３．３％～８３．３％¨２｜。２００６年扈荣良等用犬２型腺病毒为载体表达了狂犬病病毒的糖蛋白，免疫犬只后的试验结果表明该重组病毒具有良好的免疫原性和保护效应ｕ３｜。

２．１．２核蛋白亚单位疫苗

纯化核蛋白不需去污剂处理，是目前最有希望用于人类预防狂犬病的亚单位疫苗。同时，狂犬病病毒糖蛋白具有病毒中和抗体决定簇，与病毒的感染和毒力直接相关，不同毒株的糖基化位点有所不同，但核蛋白氨基酸序列高度保守，除了可诱导机体产生非中和性抗体外，还可诱导机体产生细胞免疫Ｈ引。此外，狂犬病病毒之间核蛋白序列的同源性一般高于糖蛋白序列的同源性，核蛋白序列一致的灭活疫苗能抵抗糖蛋白氨基酸序列差异较大的致死剂量病毒的攻击¨引。因此，与糖蛋白亚单位疫苗相比，核蛋白亚单位疫苗有其独到之处。２．２ＤＮＡ疫苗

万方数据垦匾丛垂堂垄查！！！！笙！旦箜！！鲞箜！塑！璺堡翌！！垫型』婴！型！！∑ｉ翌虹！：』！堡！！！！！ｙ！！！！！塑！：！将狂犬病病毒的抗原蛋白基因在真核表达载体中克隆并表达构建了狂犬病基因疫苗，即ＤＮＡ疫苗。ＤＮＡ疫苗既有亚单位疫苗和灭活苗的安全性，又有减毒疫苗或重组疫苗的免疫应答特点，在体内抗原呈递方式与自然感染相似，可同时诱导细胞免疫和体液免疫且不受母源抗体的干扰，可生产多价或多联疫苗等优点。但与其它形式的疫苗相比，基因疫苗所能诱导的免疫水平是有限的，且ＤＮＡ疫苗对免疫动物的保护率也较低。如用表达狂犬病病毒糖蛋白的基因疫苗ｐｃＤＮＡ．ＲＧＰ和商品化的精制疫苗分别免疫小鼠，结果表明基因疫苗３次免疫的体液效果与１次精制疫苗相当；而基因疫苗２次免疫的细胞免疫效果与１次精制疫苗相当。而且ＤＮＡ疫苗和精制疫苗对小鼠的保护率分别为３０．０％和８４．６％‘１引。２．３感染性克隆苗自从Ｓｃｈｎｅｌｌ等于１９９４年首次建立狂犬病病毒反向遗传操作系统以来［６引，已成功地获得了多株狂犬病病毒感染性全长ｃＤＮＡ克隆，反向遗传技术为狂犬病疫苗研究开辟了新途径。此项技术的主要优势在于，通过嵌合、定点突变和缺失突变可实现多位点人工定向减毒，而且在ｅＤＮＡ系统中疫苗基因成分稳定，减少了传统减毒疫苗在细胞培养传代时产生回复突变的危险。Ｍｏｒｉｍｏｔｏ等以狂犬病疫苗ＳＡＤＢｌ９的非致病株ＳＮ一１０的感染性克隆为基础，用银麾蝙蝠相关街毒ＳＨＢＲＶｌ８及固定毒ＣＶＳ２４来源的ＣＶＳ－Ｎ２ｃ、ＣＶＳ－Ｂ２ｃ的ＧＰ基因取代ＳＮ．１０的Ｇ基因，构建了三种重组病毒Ｒ—ＳＨＢｌ８、ＲＮ２ｃ和Ｒ—Ｂ２ｃｍｌ。与亲本株相比其毒力显著减弱，但Ｒ—Ｎ２ｃ和Ｒ—Ｂ２ｃ接种小鼠仍有致病性。２００４年Ｓｈｏｊｉ等人在ＨＥＰ—Ｆｌｕｒｙ株病毒的感染性ｃＤＮＡ克隆的基础上，利用反向遗传学的方法得到缺乏Ｐ基因的狂犬病病毒¨引。ＨｏｓｏｋａｗａｏＭｕｔｏ等以ＲＣ－ＨＬ株的反向遗传系统为基础构建的同时表达两个糖蛋白的突变病毒ＮＰＭＧＧＬ株，其生物学特性与亲代病毒相似。增殖特性、毒力特性几乎与ＲＣ—ＨＬ株一致的同时，ＮＰＭＧＧＬ株ＧＰ的表达量是亲代病毒的１．５倍，相应的ＧＰ表达量及病毒的效价随着传代次数的增加而提高。更为重要的是，用灭活的该病毒免疫小鼠后，中和抗体分析表明该病毒具有高于ＲＣ—ＨＬ株的免疫原性¨引。３小结动物用狂犬病疫苗主要包括灭活苗、减毒活疫苗和基因工程疫苗等三种形式。在各种狂犬病疫苗之中，灭活苗安全、有效，但生产成本较高，价格昂贵，且此类疫苗用量较大，不可能大批量进口与生产，不适合发展中国家的国情。弱毒活疫苗广泛应用于世界各地，尤其是发展中国家，但弱毒苗存在潜在的回复感染问题，不宜用于家养动物。与之相比，以痘病毒和腺病毒载体为基础的狂犬病病毒重组疫苗已获准在北美和欧洲对野生动物进行大范围免疫，该类疫苗在预防野生动物狂犬病以及防止狂犬病侵入家养动物和人类两个层面均起到了显著的效果，也是这些地区有效控制狂犬病流行的主要措施之一。但痘病毒、腺病毒载体均是ＤＮＡ病毒，长期使用有可能重组到动物细胞的基因组ＤＮＡ中，带来新的生物安全问题，且此类病毒基因组结构复杂，构建重组病毒较为困难。因此，选择建立在更加合理的病毒载体基础上的基因工程重组疫苗是狂犬病疫苗研究的正确方向之一。另外，随着狂犬病病毒反向遗传学技术的发展，感染性克隆苗也是狂犬病疫苗极有前途的生产方式。