超氧化物歧化酶的研究与应用 霍荣辉 运城学院，运城，2006142121 摘要：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， 简称SOD)，是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应，平衡机体内的氧自由基，己成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂，SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。目前，世界各地学者对SOD的研究方兴未艾，深入研究SOD不仅有着重大的理论意义，也有着重大的实际应用价值。现从分类、分布、结构、性质、催化机理、制备、应用等方面探讨了超氧化物歧化酶的基础研究进展。
关键字：超氧化物歧化酶；SOD；自由基；应用；研究 1 SOD概述：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一种广泛存在于生物体内，能清除生物体内的超氧阴离子自由基(O2-)维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶。具有保护生物体，防止衰老和治疗疾病等作用。 1938年Mann和Keilin[1]首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质(Hemocuprein)，1969年Mccord及Fridovich[2]发现该蛋白有催化O2，发生歧化反应的功能，故将此酶命名为超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD，EC1.15.1.1)。现已发现了3种类型的SOD：Cu/Zn SOD、Mn-SOD、Fe-SOD[3]。 2 SOD的分布、分类及理化性质
2.1 SOD的分布与分类 SOD是一类清除自由基的蛋白酶，对需氧生物的生存起着重要的作用，是生物体防御氧毒性的关键。迄今为止，科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。基于金属辅基不同，这些SOD至少可以分为Cu/ Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型。 表1 SOD的分类及分布
种 类 颜 色 分子量 分子构象 亚基数 分 布 Cu /Zn SOD Mn SOD Fe SOD 蓝绿色 粉红色 黄色 32000 80000 40000 β- 折叠 α- 螺旋 α- 螺旋 2 4 2
真核细胞 真核细胞、原核细胞 原核细胞 注: Fe- SOD 也可能存在于真核藻类及植物叶绿体基质中
[4]
2.2 SOD的催化机理 超氧化物歧化酶作用的底物是超氧阴离子自由基(O2-)，它既带一个负电荷，又只有一个未成对的电子。在不同条件下，O2-既可作还原剂变成O2，又可作氧化剂变成H2O2，H2O2又在过氧氢酶(Catalase，CAT)的作用下，生成H2O和O2，由此可见，有毒性的O2-在H2O2又在过氧氢酶(Catalase，CAT)的作用下，生成H2O和O2，由此可见，有毒性的O2-在SOD和CAT共同作用下，变成了无毒的H2O 和O2 。超氧化物歧化酶是机体内天然的自由基清除剂，催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应，清除的超氧阴离子自由基(O2-)对机体的作用。SOD催化O2-的反应如下： 2O2-+2H+ SOD H2O2+O2 2H2O2 CAT 2H2O+O2(CAT为过氧化物酶) H2O2+2GSH GSHPX GSSG+2H2O(GSHPX为谷胱甘肽过氧化物酶)
3 SOD的结构和活性影响因素
3.1 SOD的结构 超氧化物歧化酶(SOD)从结构上可分为两族：Cu/Zn-SOD为第一族，Mn-SOD和Fe-SOD为第二族。天然存在的SOD，虽然活性中心离子不同，但催化活性部位却具有高度的结构同一性和进化的保守性，即活性中心金属离子都是与3或4个组氨酸(His)、咪唑基(Mn-SOD含1个天门冬氨酸羧基配位)和1个H2O分子呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位。CuZn-SOD作为SOD结构上的第一族，是人们对于SOD结构研究的突破口，也是人们了解最多的一种SOD。比较不同来源的Cu/Zn-SOD的氨基酸序列可以发现，它们的同源性都很高[6]。有些氨基酸还很保守，在所有序列中都不变，这暗示着这些氨基酸与活性中心有关。Cu/Zn-SOD每个分子由两个亚基通过疏水作用和氢键力缔合成二聚体,肽链内部由半胱氨酸C55
和C144的巯基构成的二硫桥对亚基缔合起重要作用。Richardson用0.2nmX-射线衍
射晶体结构分析得到Cu/Zn-SOD三维结构，指出SOD的活性部位是以Cu为中心的一个“疏水口袋”(见图1)[5]。 图1 天然Cu/Zn-SOD活性中心结构 Cu和Zn处在疏水口袋底部，相距约0.63nm。Cu(Ⅱ)与四个组氨酸残基咪唑环上N原子配位形成变形的平面四方形结构，其轴向位置上还结合着一个水分子，Zn(Ⅱ)则与三个组氨酸和一个天冬氨酸配位形成畸变的四面体结构，Cu(Ⅱ)与Zn(Ⅱ)之间通过共同连接一分子组氨酸而形成“咪唑桥”结构。 Mn-SOD和Fe-SOD同属于SOD结构上的第二族，Mn-SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn(Ⅲ)是处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另3个配基His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。Fe-SOD的结构比较简单且与Mn-SOD类似，且活性中心是由3个His，1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成[7]。
3.2 SOD的活性影响因素 SOD的催化活性主要与SOD活性中心的氨基酸残基、金属离子及其配位环境、“咪唑桥”的变化有关。SOD活性中心的精氨酸和组氨酸对SOD的催化活性具有极其重要的意义。这两个氨基酸离中心金属离子非常近,而且均带有正电荷,能诱导底物O2-.，进入活性中心，并可在催化过程中提供H+以加快歧化反应速度。如这两个氨基酸残基被破坏或修饰，SOD将会失活。SOD中心金属离子的作用也不相同。对于Cu/Zn SOD，Zn(Ⅱ)的作用一是调节咪唑基与Cu的相互作用，二是稳定活性中心的结构。若除去酶分子中Zn (Ⅱ)而保留原有环境中时Cu(Ⅱ)，SOD仍有相当高的活性。Cu(Ⅱ)与酶催化作用有关,起着传递电子的作用。若除去Cu(Ⅱ)，则SOD将会失活，重新加入Cu(Ⅱ)后SOD的酶活性恢复。另一方面，Cu(Ⅱ)所处的环境对活性有重要影响。若以其它金属离子代替Cu(Ⅱ)，同时用Cu(Ⅱ)代替Zn(Ⅱ)，则酶失去全部活性。另外，只有结合态的Cu(Ⅱ)才直接与活性有关，但在一定浓度范围内，增加游离的Cu(Ⅱ) 的浓度可显著提高SOD活性[8]。 对“咪唑桥”配合物进行催化的研究表明，在催化过程中，“咪唑桥”在与铜相连的一侧的N原子迅速地发生了质子化和去质子化的变化[9]，对酶的催化活性有重要影响。
3.3 SOD的活性检测 SOD的活性测定方法一般分直接测定法和间接测定法。 3.3.1 直接法 直接测定法的原理是直接测定SOD催化反应的底物反应速度或产物生成速度。常见的直接测定方法有EPR法、脉冲辐解法、超氧化钾法等。直接法需专用的仪器，故此类方法一般实验室较难应用。 应用脉冲射解技术进行毫微秒级快速动力学跟踪，及快速冰冻结合电子自旋共振(ESR)波谱观察，来直接获取SOD和O2-的动力学信息，如极谱氧电极法。 3.3.2 间接法 间接测定法是通过某种能产生O2-的系统，使O2-进行另一个便于检测的反应，测定特征波长下的光吸收变化速率，计算SOD对这个反应的抑制程度从而间接定量SOD活性。常见的间接测定方法有黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法、邻苯三酚自氧化法、微量邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、NBT光还原法等。 由产生超氧自由基的系统和检测O2-的系统所组成，如NBT还原法、黄膘呤氧化酶法和邻苯三酚自氧化法等各种间接法都存在不同程度的问题，应用时应有所考虑。 4 SOD的分离与提取
4.1 动物SOD的分离提取 动物SOD是最早为人民所认知的，它的分离提取技术也较为成熟。人民相继从牛、猪、羊、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织中分离和纯化出SOD。SOD常用纯化制备方法有离子交换法、疏水色谱法、凝胶过滤法和金属螯合亲和层析法等。以牛血SOD提取方法为例，主要有以下几个步骤：溶血液制备、选择性热变性、超滤浓缩、丙酮沉淀、柱层析、冷冻干燥。
4.2 植物SOD的分离提取 由于疯牛病的影响，欧盟规定从1997年月1月开始，不准使用牛血SOD作为食品添剂，植物SOD的开发研究开始彰显其重要性。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关进展报道。许平[10]袁艺[11]、赵文芝[12]、余旭亚[13]等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取出SOD并进行相关研究，由于SOD活性测定方法并不统一，因此未能进行横向比较。SOD的提取方法主要有分步盐析法、有机溶剂沉淀法、层析柱法等。
4.3 微生物SOD的分离提取 4.3.1 酵母SOD的提取 有下列几种方法破壁制备SOD粗酶液：超声波处理法（JC-2型超声波处理仪处理5min）、细胞自溶法（提取5h）、酶裂解法（2%蜗牛酶液，30℃保温7.5h）、氯仿-乙醇法。将酵母菌种进行摇瓶培养，经离心收集后的菌体悬浮在磷酸盐缓冲液中，超声破壁。离心出去残渣，得粗酶提取液。将此液按5：3的比例加入乙醇、氯仿，搅拌2h，离心初杂蛋白，上清液加入0.75倍冷丙酮，得白色沉淀，将沉淀溶解于0.025mol·L-1pH 7.6磷酸盐缓冲液，透析过夜，除去小分子物质，离心后上DEAE-32柱，然后2.2~50mmol·L-1pH7.6磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SCD活性的洗脱液[14]。 4.3.2 细菌SOD的提纯 菌体用超声波破菌、3000r·min-1离心除去核酸碎片，上清液用纸浆过滤，活性部分用15%饱和度(NH4)2SO4盐析、离心收集酶蛋白，用缓冲液溶解，超滤除去小分子物质，上DE-32柱(1.5×9.0cm)，用0～0.2 mol·L-1NaCl缓冲液梯度洗脱，得到分离的SOD，冷冻干燥，备用[15]。
5 SOD的研究动态
5.1 结构性能改造 由于受到①半衰期短；②相对分子质量大，不易透过细胞膜；③口服时易受胃蛋白酶分解；④体内特异性等因素的限制，SOD很难作为药用酶广泛应用于临床中。对SOD进行化学修饰,既能保留天然酶的活性,又能提高其稳定性。SOD化学修饰的方法主要有：①对SOD的氨基酸残基进行化学修饰，主要是对非活性部位进行修饰,目的是提高其稳定性同时保留较高的生物活性；②用水溶性大分子(如聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐和聚烯属烃基氧化物等)对SOD进行共价修饰以提高酶学特性；③对SOD进行酶切改造，降低相对分子质量、减小抗原性。研究表明：经过化学修饰后的SOD基本上保持了天然酶的活性,在耐热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。