超氧化物歧化酶(SOD)
的生产工艺研究
摘要
本文主要介绍SOD的作用和两种不同的生产工艺。通过一种
传统的SOD生产工艺和一种利用选择性热变性的方法的牛血
SOD提取生产工艺的对比研究从而反应出，由如今对SOD的需
求而需要一种较新的生产工艺来取代传统工艺。讨论如何保证质
量，提高酶的回收率和降低成本。
前言
在人体的正常新陈代谢就会产生自由基、是人体活动所需要
的，但在某些特殊的情况下，体内会产生过量的自由基。如辐射、
电磁波、汽车尾气、工业废气、废水的污染均会让体内产生过量
的自由基。而自由基不到会引起人体衰老，还会让人体产生各种
疾病如风湿性关节炎、癌症、高血压、肾脏病、白内障等等。SOD
是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，
植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除
自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与
死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多
种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复
受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，
环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因
此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！
关键字: SOD 猪血 分离纯化 鉴定
材料：牛血、猪血、0.9%NaCl、95%乙醇、氯仿、丙酮、去离子
方法一:
工艺流程图
工艺要点: ⑴收集、浮洗 新鲜猪血经离心去除黄色血浆,红细胞
用0.9%NaCl溶液离心浮洗3次，收集红细胞。
⑵溶血、去血红蛋白 收集洗净的红细胞，加去离子水，在5℃
下搅拌30min,然后加入0.25倍体积的95%乙醇和0.15倍体积的
氯仿,搅拌15min;离心去血红蛋白,收集上清液。
⑶沉淀、热处理 将上清液加入1.2~1.5倍体积的丙酮，产生絮
状沉淀；离心去上清液，得沉淀物，操作要在0℃左右进行；沉
淀物加适量蒸馏水使其溶解，离心除去不溶性蛋白;上清液于
55~65℃热处理10~15min,离心除去热变性蛋白,收集黄绿色澄清
液。⑷沉淀、去不溶蛋白 0℃条件下，在澄清液中加入适量丙
酮，使其产生大量絮状沉淀；离心弃去上清液，沉淀用去离子水
溶解；离心除不溶性蛋白；上清液置透析袋中，得透析液。
⑸吸附、洗脱 将透析液加到用2.5mmol/L、PH7.6的磷酸缓冲
液平衡好的DEAE Sephadex A50柱上吸附，用2.5~5mmol/L、
PH7.6磷酸钾缓冲液梯度洗脱，收集SOD活性洗脱液。猪血SOD
的吸收峰为250nm
⑹超滤、冻干 将SOD活性洗脱液超滤浓缩后，冷冻干燥，即
可得外观带线蓝色的Cu/Zn-SOD成品。
方法二:
工艺流程图
⑴溶血液制备:新鲜牛血以3.8%柠檬酸钠抗凝血球分离机分离红
细胞,加2倍无离子水搅拌溶血30min。
⑵选择性热变性：溶血液泵入夹层反应釜，搅拌、蒸汽加热至
68℃，加入适量蛋白质沉淀剂使血红蛋白变性后，将反应液泵入
冷却罐，搅拌机搅拌，迅速冷却至15℃，按反应液总体积补加
适量蛋白质沉淀剂，搅拌1h，甩干过滤去除变性血红蛋白，过
滤液3000rpm20min低速离心，去除颗粒沉淀物。
⑶超滤浓缩：上清液经微孔过滤去除细微颗粒，经超滤器超滤浓
缩至总体积的1/200，收集浓缩液。
⑷丙酮沉淀：超滤浓缩液预冷至4℃，加入等体积预冷的工业丙
酮，放置1h，4000rpm30min冷冻离心，沉淀用少量无离子水回
溶，对无离子水透析12h，4000rpm30min冷冻离心，收集上清液。
柱层析：经处理的DEAE-52装柱，用25mM/Lph7.8PB缓冲液，
缓慢上样，用ph7。8PBS 25-200mM/L梯度洗脱，收集SOD部
分，对无离子水透析12h。
⑸冷冻干燥：透析后的酶液经浓缩，置冻干机内冷冻干燥，升温
速率控制在5℃/h
鉴定方法
SOD酶活力测定：采用邻苯三酚自氧化法，25℃自氧化速率0.07，
PH8 2，50mM Tris-Hcl缓冲液
蛋白质浓度测定：采用Lowry法，以250ug/ml BSA作标准曲线
分子量测定：采用SDS-PAGE电泳法，浓缩胶3.5%分离胶10%
紫外吸收光谱检测：扫描波长发威230~300nm。
结果与讨论
血SOD的制备从实验室走向规模工业化生产，关键问题在于
保证质量，提高酶的回收率和降低成本，通过多次重复实验与研
究，建立了红细胞连续分离技术，并证明冷冻血球和新鲜血球制
备的SOD在收率、纯度、比活等发面无明显差别；。两种方法的
工艺流程做比较，方法二的稍微要简单一点，虽然两个流程均是
用分离纯化的方法来提取SOD但是，方法二利用了热变性来去
除血红蛋白，与方法一做比较中省去了传统工艺中所用的大量氯
仿和乙醇；利用超滤技术浓缩提取液可大幅度度减少丙酮用量；
应用SOD重组技术，对SOD生产中丢失铜锌离子的酶蛋白恢复
酶的催化活性，方法二的工艺在保证SOD质量和收率的前提下
有效降低成本。牛血SOD的制备从实验室走向规模工业化生产，
关键问题在于保证质量，提高酶的回收率和降低生产成本。