内蒙古广播电视大学 “一村一名大学生计划”毕业作业

作业题目真菌的分离培养和鉴定___

教学点名称：包头广播电视大学_ 学 员 姓 名：张瑞光__________ 学 号：1015004452077___ 专 业：畜牧兽医专科____ 入 学 时 间：2010秋_________ 指 导 教 师：杨瑞芳 _________ 真菌的分离培养和鉴定 【摘要】：从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用沙堡琼脂培养基28℃培养2-3天，分离出几个真菌菌株。将分离株重新进行平板划线分离，挑取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行载片小培养，经28℃培养2—3天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。观察到簇生在分生孢子梗的顶端的呈帚状分枝的分生孢子和有隔菌丝，可鉴定为青霉类菌；观察到分生孢子梗上呈轮状着生、具有3个分隔、弯曲的孢子，可鉴定为弯孢霉类菌；观察到单细胞的芽殖孢子，并通过进一步的酵母菌生理生化测定，可鉴定为酵母菌。 【关键词】：真菌；菌落；菌丝；孢子 1 前言 真菌一词来源于拉丁文的“蘑菇”，现在真菌这一名词的概念不仅包括蘑菇，而是代表着一个相当庞大的生物类群。什么是真菌呢？从生物学的观点来看，它们是一大类真核微生物，无根茎叶，不含叶绿素，不能利用无机物来制造食物，靠寄生或腐生生活，仅少数为单细胞，其余为多细胞，大多数真菌有分枝或不分枝的丝状体，能进行有性生殖和无性生殖。从形态上分为酵母菌、霉菌、担子菌。 其实，真菌并不像其看起来的这般抽象，在我们的日常生活中几乎到处都有它们的存在，我们每个人都有过接触和不同程度的感性认识。例如酿酒、制馒头用的酵母；酒曲的曲种（曲霉和根霉）；做豆腐乳的毛霉和红曲霉；发酵饲料的黑曲霉；味美可口的蘑菇、木耳、银耳、猴头；作为中药的神曲、麦角、虫草、茯苓、灵芝；此外还有食品、衣物、用具等因潮湿而发生的霉；引起农作物病害的小麦锈病等等都是真菌。 真菌与细菌的大小、形态、结构及化学组成差异很大，单细胞个体比细菌大几倍至几十倍，具有细胞壁，但不含细菌细胞壁的肽聚糖。有些真菌因环境条件的改变而改变形态，称之为真菌的两相性，如假皮疽组织胞浆菌在动物机体呈酵母菌样。而在人工培养基上呈丝状。 真菌不仅种类多，数量大，而且分布极为广泛，与人类生产与生活有着极密切的利害关系。有些菌丝可引起人与畜禽疾病，有些霉菌还产生毒素，直接或间接的危害人类健康。因此，了解真菌的培养方法，认识其形态十分重要。 近年来在真菌分类方面趋向于采用Anisworth&bisby的《真菌学辞典》介绍的分类系统。该系统认为真菌不属于低等植物，而是属于单独成立的真菌界，界以下分为黏菌门和真菌门。真菌门再分为鞭毛菌亚门、接合菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。本研究从自然界分离到几株真菌，并用真菌分类方法对其进行了鉴定。 2 材料 2.1 病料 发了霉的红薯、酸败腐烂的苹果 2.2 培养基 2.2.1 沙堡琼脂培养基 成分：蛋白胨10克、麦芽糖40克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升 2.2.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 成分：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升 2.2.3 保存琼脂培养基 成分：蛋白胨10克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升 2.3 器材 无菌室、手提式高压蒸汽灭菌锅、电炉、天平、铁架台、灭菌培养皿、锥形瓶、漏斗、试管、烧杯、胶头滴管、石蕊试纸、接种环、酒精灯、量筒、玻璃棒、纱布、滤纸、试管塞、报纸、扎绳、标签、温箱、冰箱、盖玻片、载玻片、显微镜、杜氏管

3 方法 3.1 真菌的分离培养 3.1.1 实验的准备 沙堡琼脂培养基的制备：用天平称取蛋白胨10克、麦芽糖40克、琼脂20克，用量筒量取蒸馏水1000毫升置烧杯中混匀，在电炉上加热熔化，加热过程中不断用玻璃棒搅拌，调整PH值至5.4，倒入锥形瓶中，115℃灭菌20分钟，倾注平板，冷却[1]。 无菌室、接种箱的清洁：用酒精棉球将接种箱的内部全部擦洗干净，放入试管架、酒精灯、标签、接种环、笔、火柴等实验用具放入接种箱内，密封接种箱。依次打开接种箱与无菌室的紫外灯，紫外线灭菌20分钟。 3.1.2 划线分离培养 在酒精灯火焰下进行以下操作： （1）从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用28℃培养2-3天，分离出几个真菌菌株。将分离株重新进行平板划线分离，挑取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行载片小培养，经28℃培养2—3天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。 （2） 左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开20度左右的角度（角度越小越好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染）。划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。 （3） 右手持接种环，将上述霉变物分区划线接种于沙堡琼脂培养基平板中，划完前一个区域后将接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后与前一区域的最后一两条折线接触划出第二区域，依次类推，共划三到四个区域。划线中不宜过多的重复旧线，以免形成菌苔。 （4） 接种完毕，在皿底上作好日期，平皿倒扣，置28℃培养2-3天。 （5） 将分离培养得到的几个分离株用沙堡琼脂培养基重新进行平板划线分离，以得到纯的单一的菌落。 3.2 真菌的载片培养（小培养） 3.2.1 实验的准备 马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备：将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（注意：发霉、变绿的不要使用。）切成薄片或蚕豆大小的方块，称取所需的重量，倒入锅内，加水1000mL煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻棒不断搅拌，以免烧焦锅底。再加入事先用温水溶化的糖溶液，用二层纱布过滤。测定pH值，用1mol/L的NaOH或HCl调至pH为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL[2]。 无菌室、接种箱的清洁：同2.1.1 无菌水的制备：取5-6mL蒸馏水装入10mL小试管中，塞上棉塞，用报纸包装好，115℃高压灭菌20分钟。 3.2.2 实验的操作 取直径7cm左右的圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部，上放一个U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖，进行灭菌[3]。 为防止培养过程中培养基干燥，特在滤纸上滴加无菌水3-4mL，挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，震荡试管制成孢子悬液。用灭菌滴管吸取灭菌后熔化的固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿内的载玻片中央，并用接种环将孢子悬液接种在培养基上，然后盖上盖玻片，用镊子轻轻压一下，最后盖上平皿盖, 即成为载片小培养[4]。 3.3 真菌的保存 3.3.1 保存琼脂培养基的制备 取蛋白胨10克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升至烧杯中混匀，在电炉上加热融化，调整PH值至5.4，分装试管，115℃灭菌20分钟，摆成斜面[5]。 无菌室及接种箱的清洁：同2.1.1 3.3.2 实验操作 将划线分离培养28℃2-3天的平板从温箱取出，放入无菌室中进行以下的操作：在无菌室中靠近酒精火焰处，从平板培养基上选取可疑菌落，用接种环轻轻刮取其表面的少许孢子，拉出接种环立即伸入斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好。接种完毕，接种环通过火焰灭菌后放下接种棒，最后在斜面管壁上注明日期，置28℃温箱中培养2-3天，后置4℃冰箱中保存[6]。 3.4 酵母菌的鉴定——生化试验 3.4.1 糖发酵试验 用12.5%豆芽汁配制成2%糖溶液（棉子糖为4%）分装杜氏管。测定发酵的容器以杜氏管为主，凡能发酵某种糖则在杜氏管内小管之顶部应能看到有一定量的CO2气泡[7]。具体操作：A.将豆芽汁分装杜氏小管，每管1.2ml，15磅灭菌15分钟。B.把各种糖用灭菌蒸馏水分别配成10%的糖溶液，煮沸15分钟，稍冷，用无菌吸管吸取一定糖液，分装于杜氏管，使糖浓度达到2%（棉子糖4%），即成为糖类发酵基础培养基。C.欲鉴定的新培养菌株，接种于发酵管，25-28℃培养，每天观察结果。一般观察2-3天即可，凡不发酵者或弱发酵者，可延长观察至10天，因半乳糖酶是适应酶，故观察发酵半乳糖可延长2周至1个月[8]。 3.4.2 同化碳源试验 A.菌液制备：将酵母菌制成菌悬液（1ml无菌生理盐水接入少许约一接种环的新培养的酵母菌制成悬液）。B.浇制平板：将此悬液全部倒入经溶化并冷却至45℃左右的20ml基础培养基中，倒入培养皿，使菌体在培养基中混和均匀，静止，凝固后在28℃把培养皿倒置几小时，使表面不致太湿。C.点样：然后在培养皿底部做上碳源名称的标记，分别用无菌不锈钢匙或无菌药匙，按标记加糖少许（约米粒大），如果结果不明显可于第二天再补加一次糖。D.观察：观察结果时以葡萄糖作对照，一般是25-28℃培养1-2天观察结果，凡能同化者在所加碳源的周围形成生长圈。凡生长缓慢的酵母或是在测半乳糖同化时，可适当采用液体培养法，即在含某种碳源的液体培养集中接入酵母，25-28℃培养1-2周，以含葡萄糖的液体培养基作对照，观察酵母生长情况，是否更加浑浊或形成环、岛等，必要时可延长观察查到三周[9]。

4 结果与分析 4.1 真菌的培养性状观察 4.1.1 真菌在固体培养基上的生长表现 酵母菌在固体培养基上的生长表现：酵母菌在固体培养基上菌落呈油脂状或腊脂状，表面光滑、湿润、粘稠，有的表面呈粉粒状，粗糙或皱褶，菌落边缘整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色和红色等。 霉菌在固体培养基上的生长表现：将不同霉菌在固体培养基上培养2-3天，可见霉菌菌落有绒毛状、絮状、绳索状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定局限性（直径1-2㎝或更小），很多霉菌的孢子和菌丝能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同颜色，如黄色、绿色、黑色、橙色等。 4.1.2 真菌的载片培养的形态观察 酵母菌的载片小培养的形态观察：类似于细胞，多