细胞生物学
（三）荧光显微镜
特点：光源为紫外线，波 长较短，分辨力高于普通 显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。
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用于观察能激发出荧光的结构。 用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。
Fluorescence image of
epithelial cell, DNA in
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（二）相差和微分干涉显微技术 干涉:两列频率相同的光波在 空中相遇时发生叠加，在某些 区域总加强，在另外一些区域 总减弱，出现明暗相间的条纹 或者是彩色条纹的现象叫做光 的干涉。
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相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从 而提高了各种结构间的对比度，使各种结构 变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不 同于普通光学显微镜两个特殊之处。
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表一、几种介质的折射率
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显微镜的几个光学特点：
➢制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折 射率越接近玻璃的越好。 ➢sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为 0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 ➢普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于.2μm， 人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。
பைடு நூலகம்细胞生物学
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2、负染技术
用重金属盐(如磷 钨酸)对铺展在载 网上的样品染色； 吸去染料，干燥 后，样品凹陷处 铺了一层重金属 盐，而凸的出地 方没有染料沉积， 从而出现负染效 果，分辨力可达 1.5nm左右。
Negative Stained Actin
2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大 成像。
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3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。
R=0.61λ/N．A．其中λ为入射光线波长；N．A：
为镜口率 ＝ｎsinα/2， n=介质折射率； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。
思考：如何提高显微镜的分辨能力？
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laser confocal scanning microscope, LCSM
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LCSM Image of a Xenopus Melanophore
microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)
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二、电子 显微镜
（一）电 子显微镜 的基本知 识
1、电子 显微镜与 光学显微 镜的基本 区别
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不同光线的波长
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２、电子显微镜的分辨本领和有效放大倍数 分辨本领：是指电镜处于最佳状态下的分辨率 电镜分辨率受制样技术的影响。
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３、电子显微镜的基本构造 １）电子束照明系统 ２）成像系统 ３）真空系统 ４）记录系统
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
一、细胞培养 二、细胞工程
第四节 用于细胞生物学研究的模式生物
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第一节 细胞形态结构的观察方法
•光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 •电子显微镜：以电子束为光源。
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一、光学显微镜
（一）普通光学显微镜
1、构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置
blue and Microtubules
in green
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（四）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM •用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。
•能显示细胞样品的立体结构。
•分辨力是普通光学显微镜的3倍。
•用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形 成立体图像。
1、环形光阑（annular diaphragm）：位于光 源与聚光器之间。
2、相位板（annular phaseplate）：物镜中加 了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射 光的相位推迟1/4λ。
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用途：观察未经染色的玻片标本
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微分干涉显微镜
1952年，Nomarski发明，微分干涉 显微镜是以平面偏振光为光源，光 线经棱镜折射后分成两束，在不同 时间经过样品的相邻部位，然后经 过另一棱镜将这两束光汇合，从而 样品中厚度上的微小差别就会转化 成明暗区别，增加了样品反差，造 成了标本的人为三维立体感，类似 大理石上的浮雕。 微分干涉显微 镜适于研究活细胞中较大的细胞器， 如果接上录像装置可以记录活细胞 中的颗粒以及细胞器的运动。
(五)荧光共振能量转移技术
CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重 叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激 发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转 移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将 减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。
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应用: 1、检测酶活性变化 2、关于膜蛋白的研究 3、细胞膜受体之间相互作用 4、细胞内分子之间相互作用
第三章 细胞生物学实验技术
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第一节 细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜
第二节 细胞组分的分析方法
一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法 三、特异蛋白抗原的定位与定性 四、细胞内特异核酸序列的定位与定性 五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态 六、定量细胞化学分析技术
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（二）、主要电镜制样技术介绍 1、超薄切片技术 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚 度仅40-50nm的超薄切片， (1)固定：通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水 (2)包埋：环氧树脂包埋 (3)切片：以热膨胀或螺旋推进的方式切片 (4)染色：重金属（铀、铅）盐染色形成明暗的黑白图象
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(六)荧光漂白恢复技术
FRAP (光漂白后荧光恢复)就是在光漂白后对样本确定 区中的荧光恢复。FRAP是由没有漂白的荧光团由周围进 入漂白区FRAP的运动引起的。FRAP用于测量2-维或3-维 分子运动的力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标 明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。
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