CAR-T细胞免疫疗法的研究进展浙江理工大学任嘉锋自动化（2）班学号：2013330301070指导老师：解纯刚CAR-T细胞免疫疗法的研究进展任嘉锋2013330301070浙江理工大学机械与自动控制学院自动化2班,杭州摘要:嵌合抗原受体修饰T细胞（CAR-T细胞）技术是近年来发展非常迅速的一种过继性免疫治疗技术。
这里的CAR指的就是嵌合抗原受体,由胞外抗原结合域scFv、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。
其通过基因修改技术，将能识别肿瘤相关抗原的抗体融合表达于自体T细胞的表面，被修改过的T细胞因此具有对肿瘤细胞的靶向杀伤力。
从该技术被发明以来，CAR的设计已从仅包含单一CD3ζ信号传递结构域的第一代CAR 发展为加入了CD28 和CD137（4-1BB）等共刺激分子信号传递结构域的第二和第三代CAR。
其中，针对CD19 的CAR-T 细胞在治疗血液肿瘤中取得的成果尤为引人瞩目，同时CAR-T 细胞在针对实体瘤的治疗方面也取得了一定的成绩,但该技术同时也存在脱靶效应和细胞因子释放综合征等临床应用风险。
这里就CAR-T细胞免疫疗法的原理和在肿瘤的临床治疗领域的研究进展作综述性的阐述.关键词:CAR-T细胞;免疫疗法;基因技术;肿瘤治疗1.CAR-T细胞疗法的原理采用嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors，CARs)修饰的T细胞CAR-T 细胞治疗肿瘤的方法是近年来发展最快的一种肿瘤免疫新疗法。
T细胞对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用,在肿瘤免疫应答中起主要作用.但是肿瘤细胞表面的MHC(主要组织相容性复合物)在免疫编辑的过程中会出现表达下降的情况,这样长期形成的免疫逃逸机制, 能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击, 肿瘤快速增殖。
此外, 人体内肿瘤特异性的T细胞数量较少, 并且由于大多数肿瘤细胞不断表达自体抗原, 使得靶向这些抗原的T细胞通过免疫耐受机制被中和或移除, 数量进一步减少。
而CAR的修饰可使T细胞在获得靶向杀伤能力的同时获得更强的增殖及抗凋亡的能力，其肿瘤杀伤作用的发挥也不会受到主要组织相容性复合体(MHC)的限制。
目前, 大多数嵌合抗原受体由胞外抗原结合区[由来源于单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成, 中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体、跨膜区域和胞内信号转导区组成。
通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域”免疫受体酪氨酸活化基序”在体外进行基因重组, 生成重组质粒, 再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞, 使患者T细胞表达肿瘤抗原受体,转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞, 称之为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。
CAR-T细胞在体内、外都具有对特定肿瘤抗原高度亲和性及对抗原负载细胞高效杀伤特性。
近年来, CAR修饰T细胞技术在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗中均显示出良好的抗肿瘤效应。
目前，瑞士诺华(Novartis)集团与美国宾夕法尼亚大学共同开发的，一种针对治疗CD19 表达阳性的血液肿瘤的商品化CAR-T 细胞（CTL019）已经进入Ⅱ期临床试验阶段，并获得了美国食品药品监督管理局(FDA)正式授予的“突破性疗法”认证，使CAR-T 细胞技术在向临床广泛应用的道路上又前进了一步。
2.发展历史1989 年，Gross 及其团队第一次提出了“嵌合受体”的概念，他们将T 细胞受体的可变区用单链抗体替代，由此得到了具有抗原靶向性的T 细胞，经改造后的T 细胞不再具有MHC 的限制性，上述嵌合受体的形式已经基本形成了第一代CAR-T 细胞的雏形，该类T 细胞基本解决了由于肿瘤细胞MHC Ⅰ丢失而产生的免疫逃逸问题。
随后，在上述“嵌合受体”的设计基础上，第一代CAR 的结构基本确立——由能够特异性识别某个肿瘤相关抗原的scFv与T 细胞内信号传递结构域CD3ζ或是FcRγ进行组合。
目前，第一代CAR-T 细胞技术已在淋巴瘤、鼻咽癌、卵巢癌及肾癌中进行了初步的临床试验，由于其在体内的存活时间并不理想，从而影响了最终的临床效果。
众所周知，T细胞的完全激活需要来自TCR与呈递了抗原的MHC复合物结合所传递的第一信号，以及来自于共刺激分子受体与其配体结合后传递的第二信号，而肿瘤细胞表面常常不表达这些共刺激分子的配体，从而导致一代CAR-T 细胞缺少必要的共刺激信号，表现为失能（anergy）及体内扩增不良。
因此，为了保证CAR-T 细胞能够完全激活，第二代及第三代CAR-T 细胞引入了一个或两个共刺激信号的细胞内信号传递结构域。
共刺激信号传递结构域的加入，赋予了CAR-T 细胞更强的增殖及抗凋亡能力，其细胞因子的分泌水平及细胞毒性同时也有所增强。
由于肿瘤是一种混合性的细胞群体，而CAR-T 细胞无法对这一群体中那些细胞表面不表达靶抗原的细胞进行杀伤。
为了能彻底清除肿瘤细胞,Chmielewski 等设计了“第四代”CAR-T 细胞——TRUCKs（T cells redirectedfor universal cytokine killing）；这种被改造后的T 细胞可以在CAR 识别靶抗原后，通过激活下游转录因子NFAT（nuclear factor activated T cells）来诱导表达促炎性细胞因子白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12），从而招募环境中的其他免疫细胞（树突状细胞、吞噬细胞和自然杀伤细胞等）参与对不表达靶抗原的肿瘤细胞的清除。
此外，被募集在肿瘤附近的免疫细胞还可以通过分泌某些细胞因子（如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、IL-4 和IL-5 等）来调节肿瘤附近的微环境，解除其免疫抑制性，通过调动机体自身免疫力参与对肿瘤的杀伤.图1 4代CAR结构示意图CAR-T细胞的过继免疫治疗在2013年取得了突破性的进展。
靶向CD19的CAR-T细胞在经过了多年的发展后，技术日益成熟。
在针对急慢性粒系白血病的治疗中，过继回输的能够在体内大量扩增（约1000倍）并有效杀伤肿瘤细胞,最终获得对肿瘤的治愈疗效。
同时，针对如黑色素瘤等实体肿第九届全国免疫学学术大会瘤的临床试验也取得了显著的疗效。
3.CAR-T细胞疗法的临床效果3.1CAR-T 细胞治疗血液系统肿瘤以B 细胞表面标志物CD19 为治疗靶点构建的CAR-T 细胞，是迄今为止研究最广泛的CAR-T 细胞，是这一领域的经典范例。
最初选择CD19 作为靶点是因为该分子在 B 系列淋巴细胞白血病的肿瘤细胞表面普遍高表达，但在造血干细胞及绝大多数正常组织中基本不表达，可以防止骨髓抑制等不良反应的发生。
针对CD19 的CAR 有多种构建形式，临床试验涉及急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）、慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocyticleukemia，CLL）、非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’slymphoma，HL）和小淋巴细胞淋巴瘤（small lymphocyticlymphoma，SLL）等多种血液肿瘤。
来自多个癌症中心的临床试验结果显示，针对CD19 的CAR-T 临床治疗结果令人振奋，即使针对难治、复发的患者也能取得60% ～80% 的缓解率。
同时，已经获得的众多临床数据也为评价和改进后续CAR-T 细胞免疫治疗的临床试验方法提供了依据。
在针对CD19 这个成功的靶点开展相关工作的同时，研究人员也在积极寻找更多其他可用于血液肿瘤治疗的分子。
后来Wang 等选择CD33 作为靶点构建的第二代CAR-T细胞——CART-33（CAR.33-4-1BBζ-GFP），已用于1 例复发的急性髓系白血病病例的治疗。
患者在回输了总量为1.12×109个经改造的自体T 细胞之后，相继出现了发热、细胞因子释放综合征、全血细胞减少症和高胆红素血症等症状，而原始血细胞（Blast cells）的比例在治疗初期由大于50% 降低至6%，但后续病情却持续发展，至第9 周时原始血细胞回升至70%。
Till 等进行了针对CD20 的临床Ⅰ期试验，应用第三代CAR-T 细胞治疗了3 例患者其中2 例患者的病程在12 ～24个月内未继续发展；另1 例患者则表现为部分缓解（partial remission，PR），12个月后复发。
上述结果均不如针对CD19 为靶点的试验结果理想。
另外，还有针对CD22、CD138、CD30 和LewisY等靶点的多项CAR-T 细胞的免疫疗法也正在招募患者进行Ⅰ期临床试验。
3.2CAR-T 细胞治疗实体肿瘤CAR-T 细胞免疫疗法在实体瘤临床试验中的表现有些不尽如人意。
由于实体肿瘤一般具有包膜，不利于CAR-T细胞的浸润，且其肿瘤细胞的多样性也要高于血液肿瘤，以及肿瘤附近还存在免疫抑制微环境，上述原因均可能导致CAR-T 细胞免疫疗法对实体瘤的治疗效果不理想。
目前，实体瘤的CAR-T 临床试验相对较少，也相对不成熟，基本停留在检测安全性阶段，治疗效果更有待提高。
4.CAR-T细胞疗法的不良反应CAR-T虽然让很多癌症患者看到了希望,但其治疗手段带来的一些不良反应也不容忽视,有些不良症状有可能是致命的.4.1细胞因子释放综合征(CRS)CRS是CAR-T细胞治疗常见的和致命的不良反应。
CRS的发生与发展和CAR 结构、肿瘤类负荷和类型以及病人基因多态性和其他相关,可以通过设计安全的CARs或CAR-T细胞和严格限制每注入细胞的数量,减少CRS的发生率。
糖皮质激素和细胞因子有拮抗作用,可减少相关的死亡率。
CRS的临床症状是恶心、头痛、心动过速、低血压皮疹、气短。
患者注入CAR-T 细胞后,其体内T细胞、B细胞、NK细胞以及单核/巨噬细胞释放大量的炎性介质(包括细胞因子)，这些炎性介质触发急性炎症反应诱导上皮及组织损伤，导致微血管渗漏、心衰甚至死亡。
因此在CAR-T细胞治疗过程中及时恰当控制CRS是非常重要的。
4.2脱靶效应由于CAR-T细胞针对肿瘤相关抗原(TAA)，对其具有高度亲和力，当其与正常组织表达的TAA结合后对正常组织产生的毒性则为脱靶效应；这种毒性由抗原介导可应用抗体封闭正常组织上的TAA、降低每次输注的CAR-T细胞数量、构建跨信号CAR（CAR结构中T细胞活化信号1即CD3ζ与共刺激信号CD28分子不直接相连）或者通过引入自杀基因系统来预防及治疗这种脱靶毒性。
例如 B 细胞缺乏便是CAR19-T细胞治疗的脱靶毒性，B细胞缺乏可引起长期的低γ球蛋白血症，可通过输注丙种球蛋白替代。
5.发展预期CAR-T细胞免疫疗法是近年来十分热门的肿瘤靶向治疗技术,综合上述从各学术论文中总结出的其发展历程和目前存在的缺陷.该技术在未来的一段时间内的方向是开发更多的更有效的靶点.从下图中的CAR-T 靶点相关专利申请量趋势中可以看出对于CAR-T的靶点开发数量正朝着一个稳步上升的趋势发展.但同时我们看得出其数量并没有因为近几年该技术的热门而成快速增长的趋势,说明其新靶点的开发并不是一件易事.图2CAR-T 靶点开发相关专利申请量和FDA 批准单抗数量CAR-T疗法中存在的不良反应也有待更安全更有效的靶点的开发,未来的研究应该也会朝着这一方面发展.就目前的情况来看,CAR-T虽然在血液瘤的治疗方面效果较为突出,但仍有较长的一段路要走.至于实体瘤方面,CAR-T细胞治疗的最终目的是治愈，这就需要设计新的、能够在实体瘤微环境中存在和增殖的CAR-T细胞，目前在临床前研究方面已向这一最终目标迈出了具有重要意义的一大步。