食品中转基因成分检测第12章ELISA方法定量检测抗农达® (RoundupReady®) 转基因大豆F．Eyquem食品中转基因成分检测 第12章2ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 目 录第12章ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆引言 3酶联免疫吸附分析 (ELISA) 技术 7 实验部分 10参考文献 20食品中转基因成分检测 第12章3ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 引言本章介绍一种用免疫学技术检测转基因植物的方法，这种方法是基于对转化事件中转入基因产生的新蛋白的检测。
但是，值得注意的是，基因修饰并不总是直接特异地对应于产生新蛋白，蛋白表达量水平也并不总是足够用于检测的目的。
另外，某些蛋白可能仅在植物的特定部位表达 (如：组织特异性启动子)，或者在不同部位或不同生理时期其表达量水平也不一样。
有报道称植物中转基因产物表达量水平占总可溶性蛋白的0~2%，甚至在一些强启动子植物中也是如此 (Longstaff ，1995)。
然而，在许多情况下，文献资料报道的转入基因蛋白表达量水平 (如：批准的GM 作物) 一般低于2%的表达上限 (henner ，1997)。
免疫学分析是一种用抗体作为检测试剂的分析测定系统。
抗体是一种从动物血清中分离得到的特异性蛋白，它可特异性地结合于诱导它们产物的底物，即抗原。
抗体的制备是通过将待检测的底物 (如：CP4 EPSPS ，是一种产生农达除草剂抗性的蛋白) 注射到动物如兔子或者老鼠体内，然后动物体内的细胞会将此底物识别为外来物质并产生抗体与之对抗。
抗体经过纯化，并用可检测的标记与之连接，然后可作为检测目标底物的试剂。
免疫学检测方法发展和应用的先决条件是：得到可直接和待检测新蛋白作用的高特异性抗体。
另外，目标样品或蛋白不能有明显的降解。
在对复杂基质中的抗原进行定量的检测中，抗体是一个很有用的生物学工具。
所有的免疫学分析都是基于抗原和抗体之间的特异性结合。
抗体-抗原相互作用当免疫学家将抗体的本质确定为蛋白质时，对于抗体的大多数描述都包括：这些分子具有将抗原从溶液中沉淀出来的能力，尽管现在抗体沉淀性质已经很少用于实验性分离和检测抗原，除了在一些自身免疫疾病中抗体也很少在体内沉淀抗原。
抗体沉淀反应的作用，如图1所示，地说明了抗体分子基本和普遍的特性。
这个实验同时说明了其他的一些问题：·血清抗体 (IgG) 在与抗原反应时是二价的，它与抗原可以发生交联 (cross-link)； ·抗原与抗体反应时一般是多价的；食品中转基因成分检测 第12章4ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 ·血清抗体在自然情况下都以多克隆形式存在；·抗体可以高度特异性地识别抗原分子的结构。
图1. 单抗原及其抗体系统的沉淀曲线以抗体沉淀量和逐渐增加的抗原浓度 (抗体总量恒定) 作沉淀曲线，可分为3个区域 (图1) ：“抗体过量区”，在这个区域，抗体沉淀被抑制，可在上清液中检测到过量的抗体。
“等价区”，在这个区域，沉淀量达到最大，抗原抗体形成大的不溶性抗原抗体复合物 (蓝色显示)，上清液中检测不到抗原和抗体的存在。
抗原抗体沉淀反应能很好地描述多克隆抗体和多价抗原之间的相互作用，但一般地，它不适合于描述抗原和单克隆抗体之间的相互作用，除非抗原表现出多种一致的抗原决定簇 (如，在多糖中发现的重复碳架结构)，只有在这时，特异性的单克隆抗体才能交联并沉淀抗原。
尽管如此，单克隆抗体有更简练的方法来描述其生物学特征，这些方法提供了关于抗体抗原相互作用的一些详细信息，如平衡常数和动力学开关速率。
抗体能非常有效的用来检测和分离抗原。
化学修饰可以改变抗体的结构但是不破坏它们与抗原结合的能力，使得抗体的相对稳定性增强，从而使抗体的应用也大大加强。
抗体食品中转基因成分检测 第12章5ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 可以通过化学方法，用荧光、磁性、放射性或其它化合物进行标记，使其在不同的实验条件下实现对抗原的检测和分离。
如何制备单克隆抗体抗原对于人体来说是外源物质，如致病性细菌和病毒，以及其它侵染性物质，它们可被人体的免疫系统作为入侵者而被识别。
抗体是我们体内抵御这些侵染性物质的天然防线，可以识别抗原并有助于破坏抗原蛋白。
抗体非常有用的两个性质是，首先，它们是高度特异的；即每个抗体只能特异地结合和攻击一个特定的抗原。
其次，有些抗体一旦被一种疾病激活，它将持续对这种疾病产生抗性。
利用抗体的第二个特点就可以发展疫苗。
疫苗是一种弱化或者灭活的细菌或病毒，当它们被接种到人体中时，可以激活人体产生抗体抵御它所携带的抗原。
抗体的特异性使单克隆抗体技术变得价值非凡。
抗体不仅仅可以用于医疗，抵御疾病；它们也可以帮助诊断一系列的疾病，检测药物、病毒和细菌产物、以及血液中其它不常见或不正常的物质。
由于这种抗病物质 (即抗体) 的多样化使用，抗体的纯化质量一直以来都是科学研究所关注的焦点。
抗体制备传统的方法是向实验动物注射抗原，等抗体形成后，从动物的血清中回收抗体 (含有血清的抗体称为抗血清)。
这种制备方法存在两个问题：它产生的抗血清中包含有其它一些不需要的物质，而且这种方法所产生的抗体的量是非常少的。
通过使用一种能在自然条件下产生抗体的细胞，和一类在培养条件下可以持续生长的细胞，单克隆抗体技术可以产生大量的高纯度的抗体。
如果我们能将这种“不死”的特性，和这种可以产生我们需要的抗体物质的特性结合起来，实际上，我们就得到了一个连续工作的生产抗体的工厂。
在单克隆抗体技术中，有连续繁殖能力的肿瘤细胞，和产生抗体的哺乳动物细胞融合。
这种融合细胞称为“杂交瘤细胞”，它可持续产生抗体。
因为它们都是来源于同一类型的细胞-杂交瘤细胞，这些抗体就被称为单克隆抗体；另一方面，由传统方法产生的抗食品中转基因成分检测 第12章6ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 体是来源于多种类型的细胞，因此它们称为多克隆抗体。
下边介绍一个单克隆抗体制备的例子。
单克隆抗体的制备骨髓瘤细胞是一种骨髓中的肿瘤细胞，它可以在细胞培养中不停的生长。
当骨髓瘤细胞和产生抗体的哺乳动物脾细胞融合，其结果产生杂交的细胞，称为杂交瘤细胞，它可以产生大量的单克隆抗体。
这种细胞融合的产物集合了两个不同类型细胞的特性：持续生长的能力和产生大量高纯度抗体的能力。
因为选择性的杂交细胞只产生一种特异性抗体，其纯度比传统方法产生的多克隆抗体高很多。
在对抗疾病方面，它们与传统的药物相比具有更高效的潜力，因为药物不仅攻击外来物质，同时也会攻击人体自身的细胞，有时也产生一些不期望的副作用如过敏反应。
单克隆抗体仅仅攻击目标分子，它不会产生副作用，或使副作用大大减少。
食品中转基因成分检测 第12章7ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 酶联免疫吸附分析 (ELISA) 技术定义酶联免疫吸附分析 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 是指：应用一个酶标记的免疫反应物 (抗原或抗体) 和一个免疫吸附剂 (结合在固体支持物上抗原或抗体) 的酶免疫分析，通过不同的方法 (如：在标记的反应物和未标记的未知样品之间的竞争结合)，可用于测定未知样品的浓度。
ELISA (Clark and Adams ，1977) 依赖于抗原抗体之间的特异性反应。
ELISA 中的关键试剂是抗体，它是免疫系统应答于外来物质 (抗原) 侵染而产生的一种可溶性蛋白。
对于转基因的检测，抗原则是新产生的蛋白。
在转基因植物中，插入的基因会产生新蛋白。
可以用ELISA 的方法来评估此蛋白在转基因植物中表达量的水平。
关于特异性抗体的生产和应用的信息，在许多报道转基因植物发展的文章中可以找到 (Mohapatra et al.，1999)。
至今，商业化的能够直接应用于批准的转基因作物插入基因蛋白产物的特异性抗体还很少：有一些抗体是针对于nptII 基因产物NPTII 或APH (3') II ，和针对gus 基因的产物。
下图是进行ELISA 检测的3种不同方法：食品中转基因成分检测 第12章8ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 基于ELISA 的抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆特异性检测的方法由Lipp 等 (2000) 建立、测试和验证。
此方法的建立是基于CP4-EPSPS (5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，此酶来源于Agrobacterium sp .strain CP4) (Padgette et al.,1995) 蛋白特异性抗体的使用。
CP4-EPSPS 蛋白赋予Roundup Ready®大豆抗农达®除草剂的特性。
初步结果表明，此方法 (操作中使用商业化的ELISA 试剂盒) 可以检测大豆原料中的转基因成分含量范围在0.3%到5%之间。
原理下图表示的是用于检测CP4-EPSPS 蛋白的三明治式ELISA 示意图：微量滴定板的表面包裹着特异性单克隆捕获抗体。
当加入含有待检测蛋白的样品时，捕获抗体与抗原结合。
样品中没有结合的成分可被洗脱除去。
食品中转基因成分检测 第12章9ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 洗脱之后，加入一种与辣根过氧化物酶 (HRP) 共价偶联的多克隆抗体，该抗体可与CP4 EPSPS 蛋白的另一个抗原位点特异结合洗脱后，加入辣根过氧化物酶的显色底物四甲基联苯胺 (TMB)。
辣根过氧化物酶可催化底物产生颜色反应，颜色信号与抗原浓度在线性范围内呈一定的比例。
显色一定时间后，加入终止液终止反应。
在450 nm 波长处测量每一孔的光密度。
食品中转基因成分检测 第12章 10ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 试验部分(转基因食品成分检测，大豆试剂盒使用说明 (1999)。
Srategic Diagnostics, Inc., Rev. 052099, Vers.1.8.) 1引言下面的程序详细描述了基于ELISA 法检测农产品原材料及其加工产品中抗农达®大豆表达的CP4 EPSPS 蛋白，如大豆粉和大豆蛋白分离物。