钼蓝比色法测定斯越橘成熟果实中还原型抗坏血酸含量及体系优化————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：钼蓝比色法测定笃斯越橘成熟果实中还原型抗坏血酸含量及体系优化-农学论文钼蓝比色法测定笃斯越橘成熟果实中还原型抗坏血酸含量及体系优化谭智文，宋春艳，郑美香，崔百会，宗成文（延边大学农学院，吉林延吉１３３００２）摘要：以笃斯越橘（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）成熟果实为试材，以钼蓝比色法测定笃斯越橘果实还原型抗坏血酸（Ｒｅｄｕｃｅｄａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ，ＡｓＡ）含量进行条件优化。
结果表明，３％偏磷酸－乙酸用量为１００μＬ、５％硫酸和５％钼酸铵用量均为２００μＬ、以去离子水补充至１５００μＬ，３０℃干热恒温浴显色４０ｍｉｎ，取出室温下放置１ｈ后，在７００ｎｍ下测定，所得数据稳定，准确性适合用于笃斯越橘果实ＡｓＡ含量的测定；测得含量为（４０．２０±６．２３）ｍｇ／１００ｇＦＷ。
关键词：笃斯越橘（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）；钼蓝比色法；还原型抗坏血酸；测定与优化中图分类号：Ｏ６５６．３１文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1713-04DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.07.047越橘属植物超过４５０种［１］，广泛分布于欧洲、北美洲、中美洲、非洲东南部中部及马达加斯加岛以及亚洲等地。
笃斯越橘（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）为杜鹃花科越桔属落叶灌木［２，３］，是我国一种野生种越橘［４］。
笃斯越橘果可鲜食、也可加工，能够提制天然食品色素，浆果酸甜，果汁含有ＶＣ、ＶＥ［５，６］、Ｚｎ、Ｃｕ等，具有很大的开发前景［６］。
目前，关于越橘属植物在抗性生理、光合生理、花色苷功能及分子生物学方面有较多研究［７］。
对于越橘果实还原型抗坏血酸（ＡｓＡ）含量的测定及相关方法鲜有报道。
抗坏血酸（ＶＣ）是人体必需的水溶性维生素，在许多新鲜水果、蔬菜中主要以还原型ＶＣ（ＡｓＡ）存在［８］。
ＡｓＡ含量的测定方法有很多，如２，６－二氯靛酚滴定法［９］、碘量法［１０］、分光光度法［１１］、紫外分光光度法［１２］、高效液相色谱法［１３］、钼蓝比色法［１４，１５］等。
根据试验测定准度和精度要求，选择简便易行、价格较低的测定方法。
本研究中，笃斯越橘蓝色果实中花青素含量相对较高，不适合用２，６－二氯靛酚滴定法、碘量法进行测定。
此外，由于紫外分光光度法操作相对繁琐、光电比浊法易受到亚锡离子干扰，因此两种方法较少被采用；高效液相色谱法是极好的测定方法，能够快速、准确、简便地测定果品中ＶＣ含量，但其仪器较为昂贵，很难应用于普通实验室。
钼蓝比色法实质为分光光度法，通过试验条件优化，探究出能够准确、简便、快速地进行越橘中ＡｓＡ含量的测定方法，同时为相关果品测定提供借鉴。
１材料与方法１．１试验材料供试材料采自吉林省汪清县兰家林场，笃斯越橘成熟果实采摘后放置于冰盒内，带回实验室，－７０℃冰箱保存。
１．２试验方法１．２．１试剂与仪器主要试剂：５％的钼酸铵溶液；０．０５ｍｏＬ／Ｌ草酸－０．０００２ｍｏＬ／ＬＥＤＴＡ溶液；５％硫酸溶液；３％偏磷酸－乙酸溶液；１ｍｇ／ｍＬ标准ＶＣ溶液。
ＵＶ－２６００型紫外可见分光光度计（日本岛津制作所）；干热恒温器；真空泵。
１．２．２试材处理将试材从冰箱中取出，称量２０ｇ，倒入事先盛有一定量草酸－ＥＤＴＡ溶液研钵内研磨，然后对研磨液进行真空抽滤，滤液即刻用草酸－ＥＤＴＡ溶液定容至２５０ｍＬ，放置４℃冰箱备用。
１．２．３试验方法参照文献［１４］方法，改进如下：反应体系总体积为１５００μＬ，ＶＣ标准溶液－草酸－ＥＤＴＡ（或果汁待测液）５００μＬ、３％偏磷酸－乙酸１００μＬ、５％硫酸和５％钼酸铵用量均为２００μＬ，剩余体积以去离子水补充；３０℃干热恒温浴显色４０ｍｉｎ，取出室温下放置４０ｍｉｎ，７００ｎｍ波长条件下测定吸光度。
波长选择试验：分别取０μＬＶＣ标准溶液（对照品）、５０μＬＶＣ标准溶液，采用上述方法并设定紫外可见分光光度计参数，扫描速度为中速；峰值检测，阈值１、点４；在６５０～９００ｎｍ内进行扫描；各试剂用量试验，以０μＬ溶液为参比，吸光度调零，用量梯度为５０μＬ，范围是５０～２５０μＬ；显色温度试验：温度梯度为５℃，范围是１５～３５℃；显色时间及放置时间试验：时间梯度为１０ｍｉｎ，前者范围是１０～５０ｍｉｎ，后者范围是０～９０ｍｉｎ；精密度试验：取平行样品，测定１０次吸光度值；ＶＣ标准溶液曲线制备：ＶＣ标准溶液用量梯度为１０μＬ，范围是０～１００μＬ；加样回收试验：加入５０μＬＶＣ标准溶液。
（上述试验数据均为３次测定的均值）２结果与分析２．１最适测定波长的选择在６５０～９００ｎｍ内进行扫描（如图１），结果显示，在６９３～７０２ｎｍ内有较大吸收值（０．６３６），参考文献［１４－１６］中的结果，确定试验测定波长为７００ｎｍ。
２．２偏磷酸－乙酸用量的确定由图２可以看出，在ＶＣ反应体系中，偏磷酸－乙酸最适加入量为２００μＬ；然而，笃斯越橘反应体系中，偏磷酸－乙酸最适加入量为初始值（５０μＬ），综合考量，最终确定偏磷酸－乙酸用量为１００μＬ。
２．２硫酸用量的确定由图３可以看出，向反应体系中，加入５％硫酸的量为２００μＬ最适，因此，最终确定５％硫酸用量为２００μＬ。
２．３钼酸铵用量的确定由图４可以看出，在ＶＣ标准溶液反应体系中，５％钼酸铵最适加入量为１５０μＬ；在笃斯越橘反应体系中，５％钼酸铵溶液最适加入量为２００μＬ，综合考虑，选取加入２００μＬ５％钼酸铵溶液为反应体系最适量。
２．４显色温度的确定由图５可以看出，反应体系最适显色温度为３０℃，最终，确定反应温度为３０℃。
２．５显色时间的确定由图６可以看出，各反应体系，在显色４０ｍｉｎ时显现最大吸光度；虽然笃斯越橘果汁待测液显色时间－吸光度曲线有一定波动，为了试验一致性，确定显色时间为４０ｍｉｎ。
．６显色后放置时间的确定由图７可知，各反应体系在显色后６０ｍｉｎ其吸光度较稳定；因此，显色反应后放置６０ｍｉｎ，然后测定其吸光度。
２．６优化试验精密度评价按照“１．２．３”试验方法，做１０次平行测定，结果如表１所示。
ＶＣ标准溶液、笃斯越橘吸光度较稳定，ＲＳＤ≤２．０％，表明优化后反应体系的精密度良好。
２．７标准曲线的制备与样液ＶＣ含量的测定按“１．２．３”的试验方法，绘制标准ＶＣ加入量与吸光度的关系（如图８），标准ＶＣ含量在０．００６７～０．０４００ｎｇ／μｇ内线性关系较好，服从朗伯－比耳定律，所得线性方程为ｙ＝０．１２３１ｘ－０．０２２５（ｎ＝６），Ｒ２＝０．９９４８，方程拟合较好，能够用于测定。
２．８加样回收试验参照上述方法进行吸光度值测定（ｎ＝５），结果见表２，平均回收率为８０％～１２０％，ＲＳＤ≤２．０％，说明试验准确度良好。
３小结与讨论采用钼蓝比色法测定果蔬中ＡｓＡ含量，选取测定波长有所差异，由于反应体系的不同，反应最大波长会有所不同。
在最适波长选取上，参考已有研究（７００ｎｍ［１４］、７００．１ｎｍ［１６］、７０５ｎｍ［１５］、７４６ｎｍ［１７］、７６０ｎｍ［１８］、８２０ｎｍ［１９］、８３９ｎｍ［２０］），结合图像扫描，最终选取７００ｎｍ波长。
钼蓝比色法能够较好地应用于笃斯越橘果实ＡｓＡ含量的测定；笃斯越橘成熟果实（蓝果）ＡｓＡ含量为（４０．２０±６．２３）ｍｇ/１００ｇＦＷ）。
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