作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室(汪治清、杨新科);北京军区第二六一医院(佟玉品)#综述#Aptamer核酸药物的研究进展汪治清佟玉品杨新科Ap tamer指的是能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸112。

体外筛选技术的发展和PCR技术的应用,使得Ap tamer的研究近年来有了长足的进步,筛选到了一大批能与各种蛋白或小分子特异紧密结合的核酸分子(Aptamer)。

这些Aptamer包含了RNA、双链DNA、单链DNA 等多种形式的寡核苷酸,其配体的性质各异。

体外筛选Aptamer不仅增强了人们对核酸-蛋白相互作用的认识,也为寻找新药提供了一条途径。

Aptamer核酸药物的研究近年来也取得了一些可喜成果。

我们拟就该方面的进展及相关问题作一综述。

1Aptamer筛选的一般程序及要点各种分子的Aptamer筛选的程序大同小异,多采用亲合方法,即固定配体,使之与扩增的寡核苷酸库混合培养,待配体与寡核苷酸结合后洗去非结合核酸,然后洗脱配体-aptamer复合物,回收核酸,扩增,再进入下一轮筛选。

RNA 寡核苷酸库多从相应的DNA库转录而来,单链DNA库通过不对称PCR或从双链DNA库变性而来。

Aptamer筛选最重要的一条是如何保证核酸库的多样性。

从理论上讲,自由核酸的长度越大,库容就越大,但一般说来与蛋白或其他分子相互作用的核酸序列不会超过100bp,多集中于15~45bp之间。

对双链DNA来说,库容达1013便可进行有效筛选,单链DNA及RNA库容要求更低。

为保证PCR扩增的效果,寡核苷酸两端应为AT丰富区且不应有对称结构。

PCR扩增时,为防止某些特殊序列的超比例扩增,循环次数一般不超过20次,但为保证库容量,加大体系进行大规模扩增是必需的。

2病毒相关的aptamer核酸药物用于抗病毒的aptamer多RNA分子,与病毒基因表达调控有关的蛋白作为其作用靶点,如HIV的Rev、Tat、RT及HCV的NS3等均是理想的作用靶点。

HIV的Rev蛋白是一相对分子质量为19000的调节毒粒蛋白表达的蛋白,主要功能是促进HIV基因表达由早期(转录调节蛋白mRNA)向晚期(转录HIV结构蛋白mRNA)的转化及促进晚期转录的进行,还在转运结构蛋白mRNA进入细胞质的过程中发挥作用。

Rev蛋白的上述作用是通过与env和gag-p ol mRNA上的一段234碱基的Rev效应元RRE的特异结合来实现的,而这种结合主要是Rev蛋白中富含碱性氨基酸的14肽段与RRE二级结构B茎区(60base),特别是其中46~48位的GGG的特异结合。

RRE区核苷酸被部分乃至全部随机变用以寻找更高亲和力的序列,从含32个随机核苷酸的RNA库中发现了新的Rev结合序列122。

Ye等132还测定了一Rev-aptamer复合物在可溶状态下的结构,发现了G-A,A-A的/错误0匹配及UAU三联核苷酸与Rev中,两个精氨酸侧链的相互作用,为以Rev为靶点的药物设计提供了新的思路。

RNA aptamer用于治疗,必须能被有效转录,在体内能抵抗快速降解,并能正确折叠且快速到达有效部位。

Good 等142基于人tRNA Met和U6SnRNA启动子,构建了一个表达盒,用于治疗的小分子RNA被保护在其中。

在细胞中,全长的转录产物高达2@107~1@109个,插入的HIV Rev结合序列则能有效的抑制HIV-1的基因表达,在AIDS的基因治疗方面展示了良好的应用前景。

Konopka等152比较了Rev-ap tamer及针对HIV-1Rev基因的核酶的抑制病毒作用,发现Rev-ap tamer能有效抑制病毒p24的产生,与核酶具有相近的效果,且核酶并不能增强aptamer的抑制作用。

人们对于这些核酸药物的输入方式也作了一些探讨,发现脂质体内不仅能保护核酸免受核酸酶的降解,也能有效地进入细胞。

进一步实验发现在RSV启动子下,这一RNA-aptamer可使病毒产生降低88%,C MV启动子自身能与HIV争夺转录因子,从而抑制病毒的复制,因而不适用于检验aptamer的抗病毒作用162。

T at蛋白是HIV反式激活蛋白。

TAR(反式激活效应元件)位于HIV基因组+1到+57~+60位。

TAR RNA在+1~ +59位间形成一个由4段茎区和1段6核苷酸环区的稳定二级结构,在第Ó及第Ô茎区之间由UCU构成一个凸出部,是T at的结合位点。

Tat与完整TAR结合,加上与其他细胞因子及上游启动子、增强子的结合来诱导HIV在细胞中的复制。

针对T at蛋白的RNA-aptamer被设计成与TAR竞争性结合tat以阻止病毒复制。

Lisziewicz172构建了一质粒,将50个串联的TAR RNA置于HIV-1LTR之下,在瞬时转染试验中,能抑制90%受tat调节的基因的表达,若将gag RNA特异性核酸引入该质粒,在人T细胞系Molt3中能抑制99%HIV-1或SIV的复制,并可维持14个月之久。

Sullenger等182则将TAR与tRNA Met嵌合在一起,通过RNA聚合酶的作用来获取大量的TAR,与Tat结合以防止HIV在细胞中的复制。

Katahira等192筛选的37mer aptamer与Tat的结合力比天然的TAR高133倍。

结构研究表明该aptamer的两个UAU三联碱基与Tat中的精氨酸侧链及谷氨酸主链间形成的氢键起着关键作用。

该aptamer与Tat以1B1的方式结合,在体内与体外试验中均具有很强的抑制病毒复制作用。

阻断Ta-t TAR相互作用的另一途径是封闭TAR的Tat结合区。

Bioizian等1102从一30自由核苷酸的DNA文库中筛选到一些TAR的ap tamer,并用核磁共振的方法测定了TAR-aptamer复合物的结构。

该ap tamer呈现并不严紧的茎-环结构,顶环有一段共同序列5c-ACTCCCAT,中间6个核苷酸与TAR的顶端区互补。

二级结构显示DNA aptamer茎结构及TAR的茎形成了半连续的螺旋。

此发现为RNA结构的非反义寡核苷酸的研究提供了良好的启示。

一些TAR的RNA aptamer能形成非典型的发夹结构,在顶端环中有共同的5c-GUCCAGA-3c序列,其中GA对于TAR-ap tamer的高亲和力至关重要。

Tuerk等122在实验中还分离到了HIV反转录酶(RT)的RNA配体,但与禽成髓细胞性白血病病毒(AMV)及莫罗尼鼠白血病病毒(MMLV)的反转录酶不能结合。

这种aptamer能同时抑制R T的RNA依赖的DNA聚合酶活性及RNase H的活性,是潜在治疗AIDS的aptamer药物。

Kensch等1112发现的HIV-1的RT RNA aptamer与RT具有极高的结合力,并且这种结合高度特异,该aptamer与HIV-2的RT结合力比HIV-1低4个数量级。

Jing等1122还分离了HIV-1整合酶的单链DNA aptamer,核心环可依次结合3个K+,并且与K+的结合能引起环的变构,从而加固与HIV整合酶的结合而发挥抗HIV-1的活性。

HCV非结构蛋白NS3为70000~72000,N端含有丝氨酸蛋白酶所特有的Asn-His-Ser催化活性中心,C端具有三磷酸酶(NTPase)及RNA解旋酶(Helicase)活性。

NS3在HC V多蛋白前体的裂解及HCV的复制中起重要作用。

Urvil等1132分离到了针对NS3蛋白酶结构域的RNA aptamer,结合常数为650nmol P L,体外能很好的抑制NS3蛋白水解活性,该aptamer的G28~U34,A47~A55残基的磷酸基团与NS3之间的静电作用对于二者的结合尤为重要。

Wang等1142分离到的NS3蛋白酶RNA aptamer有保守的GA(A P U)UGGGAC序列,与NS3的结合常数达到10nmol P L,能抑制99%的NS3蛋白酶活性。

突变研究表明,aptamer的Ñ及Ó号茎与Ó号环对维持aptamer的特异性至关重要。

而NS3的Arg130、Arg 161为二者相互作用所需要的。

Kumar等1152也分离到2个针对NS3的RNA aptamer,能同时抑制NS3的蛋白酶、解旋酶的活性,可望成为抗-HCV的药物。

Weiss等1162将Syrian金仓鼠朊蛋白rPr23-231与GST融合,用于筛选aptamer得到RNA分子,能特异结合PrP而不结合GST。

该aptamer能形成G-四边形结合于PrP的N端23~ 52位。

在有抗-PrP抗体的野鼠、仓鼠及牛的脑组织匀浆中,该ap tamer均能检测出PrP,在患羊瘙痒症鼠的脑组织匀浆中,该aptamer不能识别PrP27~30(缺少N端60个氨基酸)。

该aptamer在传染性海绵样脑病的诊断方法的发展中迈出了重要一步。

3生长因子及肿瘤蛋白相关的aptamer药物近年来,对生长因子及肿瘤蛋白的aptamer的研究方兴未艾。

肿瘤微血管为肿瘤生长提供养分,血管内皮生长因子VEGF对于肿瘤血管的形成起着重要作用,因而也被选作筛选抗肿瘤aptamer的靶点。

聚乙二醇偶联的VEGF165的RNA ap tame-r NX1838是第一个进入临床试验的aptamer。

在体外实验中,NX1838能有效阻止VEGF与人脐带血管内皮细胞HUVECs的结合,并以剂量依赖方式阻止了VEGF调节的KDR和PLC-C磷酸化、钙离子的流动及VEGF诱导的细胞增殖。

在恒河猴实验中,1mg P kg aptamer静脉注射可使血浆中ap tamer浓度达到25.5L g P mg半衰期为9.3h,清除率为6.2 ml P h1172。

安全实验表明NX1838不会引起毒副作用和抗体产生。

在人类临床试验中,每只眼1~2mg的剂量是安全有效的。

在裸鼠Wilms肿瘤实验中连续5周的NX1838治疗可使肿瘤萎缩84%1182。

Pigpen蛋白在实验性大鼠脑神经胶质瘤微血管内皮细胞高度表达。

Blank等1192以该脑瘤的内皮细胞作为靶点,筛选到了一批能结合Pigpen蛋白的单链DNA ap tamer,这种以整个细胞作为靶点为筛选ap tamer提供了更大的可能性和多样性。

血小板衍生的生长因子PDGF及其受体见于多种肿瘤中,可加速肾小球系膜细胞增生和基质积累从而造成多种进行性肾病。

在大鼠肾小球性肾炎模型中,静脉注射聚乙二醇偶联的PDGF aptamer,在第6天、第9天能分别降解64%和78%的肾小球系膜细胞有丝分裂。

对这类肾炎的长期治疗也达到了同样令人满意的效果1202。

Oncostatin M(OSM)是一多功能的IL-6家族细胞因子,作为强有力感染因子,可作为类风湿性关节炎的侯选对象。