单克隆抗体技术单克隆抗体的克隆化方法经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。

克隆的时间一般说来越早越好。

因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。

但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。

克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。

一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。

克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。

（一）有限稀释法1．材料（1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。

（2）HT培养基2．操作方法（1）取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。

并取样进行台盼兰染色，计数。

（2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。

（3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。

（4）5％CO2饱和湿度，37℃培养。

（5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

（6）克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。

（7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。

（二）软琼脂克隆化借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。

2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。

3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。

4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。

5．DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。

6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。

7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。

8．用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。

于37℃CO2箱孵育1h~2h。

从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。

（三）显微镜操作法在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×108细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。

（四）荧光激活分离法用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。

其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。

单克隆抗体的制备（一）杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。

不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。

而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。

杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。

如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。

产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。

利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。

1．材料（1）经高压灭菌的降植烷。

（2）Balb/c鼠：5~8周龄。

（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。

（4）RPMI—1640培养液（5）新生牛血清2．操作方法(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周内种植细胞。

(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—1640液洗涤一次，1 000r/min离心10min。

(3) 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。

(4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107个细胞/ml）。

(5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。

血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。

（二）单克隆抗体的提纯1．材料(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液(5) 饱和硫酸铵液(6) DEAE—纤维素柱2．操作方法（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。

（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。

（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min离心10min，去上清。

（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混浊）。

（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20 mMol/L NaCl）中透析除盐。

（6）离心去沉淀。

（7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量1A 280unit=0.8mg蛋白质一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。

（8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。

透析样品以Tris 缓冲液等量稀释。

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。

大部分单克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脱。

测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。

杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。

免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。

免疫多次的多为IgG。

（三）单克隆抗体的鉴定1．杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行。

2．单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。

3．单抗的特异性鉴定可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。

4．单抗的效价测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。

不同的测定方法效价不同。

培养上清液的效价远不如腹水的效价。

采用凝集反应，腹水效价可达5×104。

而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。

单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。

5．必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。

单克隆抗体技术抗原提纯与动物免疫对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。

如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。

可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。

选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。

为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。

免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。

免疫间隔一般2～3周。

一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。

末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。

骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。

如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是Sp2/0细胞株。

该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。

细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。

融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。

骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。

在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feedercell）。

常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。

亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。

在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。

饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。

细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。

其后吧培养液稀释PEG，消除PEG的作用。

将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。

融合过程中有几个问题应特别注意。

①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。

应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。

②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml 培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。