染料废水脱色最新方法 1 引言(Introduction) 直接染料是一类能够直接让纤维及其他物质着色的染料，也是最为常见的染料种类之一。但在直接染料使用过程中约有10%的染料被排放到水中，造成严重的水环境污染。另外，由于直接染料具有较强的亲水性，导致直接染料废水很难达到较好的处理效果，因此，研究直接染料废水处理技术对于未来直接染料的持续应用具有重要的意义.
目前，针对染料废水的处置方法主要包括物理、化学和生物法。其中，物理和化学法虽然具有较好的脱色效果，但存在COD去除率低、成本高、产生二次污染等特点，严重阻碍了染料废水处理技术的推广和应用。而生物法处理染料废水具有持续性降解、环境友好且对环境产生的二次污染更小等特点。目前在染料废水治理方面应用较多的微生物主要包括细菌、白腐真菌、放线菌和藻类等.其中，白腐真菌凭借其广谱、高效、低耗、适用性强的生物降解能力，对多种结构的染料具有明显的脱色能力。自20世纪80年代初，Glenn和Gold首次发现黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)可以对部分聚合染料脱色降解以来，人们陆续开展了P. chrysosporium对偶氮、蒽醌、三苯甲烷等不同类型染料降解的研究。近年来，具有脱色能力的白腐真菌被不断挖掘，如彩绒革盖菌(Coriolus versicolor)、变色栓菌(Trametes versicolr)、灵芝(Ganoderma sp.)、粗皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、一色齿毛菌(Cerrena unicolor)等。目前，人们对白腐真菌降解染料的研究已经深入到分子水平，对其降解机理有了一定的了解.但由于白腐真菌发挥降解功能受碳源、氮源、pH、金属离子、盐度、温度等因素的影响，因此，白腐真菌在染料废水治理方面的工业化应用仍存在着诸多问题需要解决.
因此，本研究以直接大红染料为研究对象，在进行菌株CB1鉴定的基础上，采用单因素及正交试验探究菌株CB1脱色直接大红染料的优化条件，以期为菌株CB1在直接染料废水治理方面的应用奠定基础.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 材料2.1.1 供试菌株 菌株CB1由本实验室人员分离于野外朽木上，菌丝体保存于贵州大学林学院森林保护学科实验室.
2.1.2 染料 直接黑CT、直接金黄2GT、直接大红4BS、直接嫩黄5GL、直接兰B2RL等染料及其他化学试剂均购自上海生物工程技术有限公司.
2.1.3 培养基 PDA培养基：称取去皮新鲜马铃薯200 g，加入适量水煮沸20 min后，用4层纱布过滤，取滤液依次加入葡萄糖20 g、琼脂粉15 g，蒸馏水定容至1 L，pH自然;PDB培养基：PDA培养基制作过程中不加入琼脂粉所得液体发酵液;染料发酵液：PDB培养基制作过程中向培养基中加入直接大红染料，使染料终浓度为50 mg·L-1.
2.1.4 试剂盒 DNAquick快捷型植物基因组非离心柱型试剂盒(TIANGEN). 2.2 方法2.2.1 菌株CB1的鉴定 挑取PDA斜面菌株CB1的菌丝接种于PDA平皿中央，28 ℃下暗培养7 d，分别于接种后的第1、3、5、7 d观察菌丝生长状况及颜色变化等.同时于第7 d，挑取培养皿中尖端菌丝进行显微结构的观察，完成菌株的形态学鉴定;刮取5皿新活化的菌株CB1菌丝，利用DNAquick快捷型植物基因组非离心柱型试剂盒(TIANGEN)提取菌株CB1的基因组DNA.以基因组DNA为模板，利用ITS1和ITS4真菌通用引物扩增菌株CB1的ITS序列.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后送上海生物工程有限公司测序，序列校正无误后，提交至NCBI的Genbank，并将该序列与Blast比对结果中的序列进行比对分析.同时选取一株偏肿栓菌(Trametes gibbosa)的ITS序列作为外源基因，利用Clust2.0进行序列比对分析，利用MEGA5.0软件的Neighbor-joining法构建系统发育树.
2.2.2 菌株CB1对5种直接染料的脱色 在PDA培养基制作的过程中，向培养基中分别加入直接黑CT、直接金黄2GT、直接大红4BS、直接嫩黄5GL、直接兰B2RL染料，使染料终浓度为50 mg·L-1.培养基经121 ℃高温高压灭菌后，无菌条件下制作PDA平皿.截取直径8 mm新活化菌株CB1的菌丝块于平皿中央，28 ℃下暗培养10 d后，观察平皿脱色情况，以不接入菌丝、含相同浓度染料的PDA平皿作为对照.
2.2.3 菌株CB1对直接大红染料脱色的单因素优化 碳源和氮源种类对菌株CB1脱色直接大红的影响：在染料发酵液制作过程中分别以20 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉作为碳源，分别向染料发酵液中加入1 g·L-1的硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、尿素、蛋白胨作为氮源，分别取上述40 mL发酵液加入到100 mL三角瓶中，121 ℃高温高压灭菌后，分别向三角瓶中转入直径8 mm新活化的菌株CB1菌丝块3片，于28 ℃暗培养9 d;以染料发酵液中接入直径8 mm新活化的菌株CB1菌丝块3片作为对照，分别在第1~9 d测量吸光值，计算对应处理的染料脱色率.
pH对菌株CB1脱色直接大红的影响：在100 mL三角瓶中加入染料发酵液，分别调整液体培养基的pH为3、5、7、9、11，经121 ℃灭菌后，向三角瓶中接入直径8 mm新活化的菌丝块3片，于28 ℃暗培养9 d，以pH自然，含有等量染料的发酵液作为对照，分别在第1~9 d测量吸光值，计算对应处理的染料脱色率.
金属离子对菌株CB1脱色直接大红的影响：在100 mL三角瓶中加入40 mL染料发酵液，分别向三角瓶中加入1 mmol·L-1的CuSO4、MnSO4、CaCl2、MgSO4、ZnSO4、FeCl3，经121 ℃灭菌后，向三角瓶中接入直径8 mm新活化的菌丝块3片，于28 ℃暗培养9 d;以染料发酵液接入直径8 mm新活化的菌丝块3片作为对照，分别在第1~9 d测量吸光值，计算对应的染料脱色率.
2.2.4 正交试验优化菌株CB1对直接大红的脱色 在单因素试验得出的较优pH条件下，选择较优碳源(A)、氮源(B)、金属1离子浓度(C)和金属2离子浓度(D)设计四因素三水平L9(34)的正交试验，正交试验因素和水平见表 1.在100 mL三角瓶中加入40 mL染料发酵液，按L9(34)的正交表调整培养基中碳源浓度、氮源浓度和2种金属离子浓度进行9个不同处理的脱色试验，发酵液经121 ℃高温高压灭菌后，向三角瓶中加入直径8 mm新活化的菌丝块3片，于28 ℃暗培养9 d，分别在第1~9 d测量吸光值，计算对应处理的染料脱色率.
表 1 正交试验优化菌株CB1脱色直接大红染料的因素水平 2.2.5 正交试验的验证 在正交试验的基础上，按正交试验最优条件配置含有50 mg·L-1直接大红染料的PDB液体培养基，121 ℃高温高压灭菌后，向三角瓶中加入直径8 mm新活化的菌丝块3片，于28 ℃暗培养9 d，分别在第1~7 d测量吸光值，计算对应的染料脱色率.
2.2.6 染料吸光值的测定及脱色率的计算 在菌株CB1液体发酵的过程中，分别于培养第1、2、3、4、5、6、7、8、9 d吸取1.2 mL发酵液，10000 r·min-1离心5 min，吸取上层发酵液1 mL，于直接大红4BS染料最大吸收波长λmax=495 nm下测定染料吸光值，以相同处理条件下不接菌的染料发酵液作为对照.测得对照吸光值为L0，不同时间处理吸光值为Lt，则染料脱色率R=(L0-Lt)/L0×100%.
3 结果与分析(Results and analysis)3.1 菌株CB1的鉴定 菌株CB1生长很快，28 ℃下暗培养7 d后可铺满平皿(直径9 cm)，培养基无明显颜色变化;菌丝紧贴于琼脂培养基表面生长，成绒毛状白色菌落，表面平滑;平皿边缘菌丝为升起的羊毛状(图 1a)，这与由庆和何艳喜对变色栓菌(Trametes versicolor)的形态学鉴定结果相类似(何艳喜，2010; 由庆，2016).菌株CB1的ITS序列扩增得到一长度为643 bp的序列，该序列提交至NCBI数据库获得的Genbank号为KY949632.菌株CB1 ITS序列Blast比对的前100条结果中，该序列与Genbank号为AB811868.1和KJ528276.1的T. versicolor的ITS序列相似性高达100%，与Genbank号为AB811857.1、KC176306.1、FJ810146.1等70余株T. versicolor不同菌株的ITS序列相似性达99%.选取菌株CB1的ITS序列及其Blast比对结果中部分序列及一株T. gibbosa ITS序列共同构建的系统进化树见图 2.由图可知，菌株CB1与不同菌株来源的T. versicolor的ITS序列构成一个分支，分支内亲缘关系较近，而T. gibbosa的ITS序列单独作为一个分支，与菌株CB1及T. versicolor的ITS亲缘关系较远.因此，结合形态学与分子生物学的鉴定结果，将菌株CB1鉴定为变色栓菌，命名为Trametes versicolor CB1. 图 1菌株CB1形态学鉴定(a.菌株CB1菌落正面;b.菌株CB1菌落反面;c.菌株CB1菌丝显微结构，箭头指向为索状联合)
图 2菌株CB1 ITS序列的系统发育树 3.2 T. versicolor CB1对5种直接染料的脱色 固体条件下，T. versicolor CB1对5种直接染料脱色10 d后的结果见图 3.由图可知，T. versicolor CB1对直接黑CT、直接金黄2GT、直接大红4BS、直接嫩黄5GL、直接兰B2RL 5种直接染料均有脱色能力.肉眼观察平皿颜色变化可发现，T. versicolor CB1对直接大红染料的脱色效果相对更明显，故在接下来