现代医药卫生2018年11月第34卷第21期JModMedHealth，November2018，Vol.34，No.21·论著·D⁃半乳糖诱导小鼠原代皮肤成纤维细胞衰老模型的建立*张鑫，黎静，鲁晴，黄华生，林毓君，唐春女，潘璐璐，莫书荣△（广西医科大学生理教研室，广西南宁530021）【摘要】目的构建D⁃半乳糖诱导小鼠皮肤成纤维细胞（MSF）衰老模型。方法取5~7d昆明乳鼠背部皮肤，采用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得MSF，通过形态学观察及Vimentin免疫组织化学法鉴定MSF细胞。分别用不同浓度D⁃半乳糖诱导MSF细胞0、24、48h，采用β⁃半乳糖苷酶衰老染色、逆转录⁃聚合酶链反应（RT⁃PCR）检测衰老相关基因p53、细胞免疫荧光法分析Sirt1基因表达水平，并分析细胞衰老情况。结果光学显微镜下细胞呈多突的梭形或星形的扁平细胞，Vimentin蛋白免疫组织化学分析呈阳性。β⁃半乳糖苷酶衰老染色实验结果显示，不同浓度D⁃半乳糖诱导后染色阳性细胞数量较对照组显著增多，差异有统计学意义（P<0.01）。在D⁃半乳糖（20g/L）诱导24、48h后，与对照组比较，衰老MSFp53基因表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；细胞免疫荧光结果显示，D⁃半乳糖诱导48h后Sirt1蛋白表达水平明显降低。结论通过Ⅰ型胶原酶消化法及D⁃半乳糖诱导法成功建立了衰老模型。【关键词】半乳糖；细胞衰老；成纤维细胞；基因，p53；Sirt1蛋白DOI：10.3969/j.issn.1009⁃5519.2018.21.002文献标识码：A文章编号：1009⁃5519（2018）21⁃3268⁃03EstablishmentofD⁃galactoseinducedprimaryskinfibroblastsagingmodelinmice*ZHANGXin，LIJing，LUQing，HUANGHuasheng，LINYujun，TANGChunnyv，PANLulu，MOShurong△（DepartmentofPhysiology，GuangxiMedicalUni⁃versity，Nanning，Guangxi530021，China）【Abstract】ObjectiveToestablishanagingmodelofmiceskinfibroblasts（MSF）inducedbyD⁃galactose.MethodsTheskinonthebackof5-7dmicewasobtained.AndtheMSFwereobtainedbytypeⅠcollagenasedigestion.ForidentifiedMSF，morphologyobservationandcellimmunohistochemistrywasdetected.AfterMSFtreatmentwithD⁃galactosefor0，24，48h，β⁃galactosidaseagingstaining，reversetranscriptionpolymerasechainreaction（RT⁃PCR）ofsenescencerelatedgenep53andcellularimmunofluorescenceofSirt1weredetectedforanalysisofcellsenescence.ResultsThecellsobtainedfromtypeⅠcollagenasedigestionwereshowedinspindle⁃shapedorstar⁃shapedflatcellwithprotrusionsunderanopticalmicroscope.AndVimentinproteinwaspositivestainingintheimmunohistochemicalanalysiswhichsuggestedthattheprimaryculturedcellswereMSF.β⁃galactosidaseassayinMSFshowedthatthenumberofpositivecellsinMSFwithdifferentconcetrationofD⁃galac⁃toseweresignificantincreasedwhencomparedwiththoseofcontrolgroupin24hand48h，therewereStatisticalsignificance（P<0.01）.AfterinductionbyD⁃galactose（20g/L）24hand48h，therelativemRNAexpressionsofp53inMSFwerehigherthanthatofcontrolgroup，therewereStatisticalsignificance（P<0.01）.TheproteinofSirt1inMSFinducedbyD⁃galactosewerelowerthanthatofcontrolgroup.ConclusionD⁃galactoseinducedprimaryskinfibroblastsagingmodelinmiceisestablishedbytypeⅠcollagenasedigestionandD⁃galactoseinductioninthisstudy.【Keywords】Galactose；Cellaging；Fibroblasts；Gene，p53；Sirt1protein*基金项目：国家自然科学基金资助项目（81560505）作者简介：张鑫（1990—），硕士研究生，主要从事皮肤衰老的分子机制的研究△通信作者，E⁃mail：mosr28@126.com随着我国人口数量的不断增加，人口老龄化问题逐渐突出，因此衰老性疾病和亚健康的衰老性疾病等随之而来。抗衰老研究及如何预防和延缓年龄相关疾病的发生和发展将有利于提高人们的生活质量，减少其家庭的经济负担，已逐渐成为医学界关注的热点。衰老最先表现为皮肤衰老，皮肤是人体最大的器官，由表皮、真皮和皮下组织构成，其中真皮为皮肤提供各种营养物质，成纤维细胞是真皮的主要细胞组成，维系着皮肤正常的生理结构和功能[1]。衰老的皮肤在结构和功能上将发生改变[2⁃3]。因此，皮肤成纤维细胞衰老模型在研究衰老机制、表现及筛选延缓衰老药物起着重要作用。本研究旨在建立成纤维细胞（MSF）衰老模型，为开展皮肤衰老及老年相关疾病的研究提供实验基础。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物选取5~7d昆明乳鼠，购自广西医科大学实验动物中心。1.1.2主要试剂高糖DMEM培养基（美国Gibco公··3268现代医药卫生2018年11月第34卷第21期JModMedHealth，November2018，Vol.34，No.21司）、Ⅰ型胶原酶（美国Invitrogen公司）、β⁃半乳糖苷酶细胞衰老染色试剂盒（上海碧云天公司）、鼠抗Vimentin单克隆抗体（武汉博士德公司）、鼠抗Sirt1单克隆抗体（SANTACRUZ公司）、逆转试剂盒（Thermo公司）、液体DAB酶底物显色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）。4，6⁃二脒基⁃苯基吲哚（DAPI）（Solarbio公司）1.2方法1.2.1MSF的培养取5~7d的昆明乳鼠，用75%乙醇浸泡消毒30min，用消毒过的手术剪分离乳鼠的背部皮肤5cm×3cm，将分离下来的皮肤置于10cm的培养皿中，用含1%青霉素⁃链霉素的去离水磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗2次，吸净DPBS，去除血管脂肪，用手术剪将皮肤组织剪碎并将组织碎块转移到15mL离心管内，然后加入10mL的0.1%Ⅰ型胶原酶（无血清的高糖DMEM培养基），并吹打使得皮肤组织碎块分散，将离心管放入到CO2细胞培养箱中消化90min，并且每隔30min振荡摇晃离心管1min。消化完后离心机以1500r/min速率离心5min，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM清洗2次，以1000r/min离心速率离心3min，弃上清，再用含15%胎牛血清的高糖DMEM重悬组织块并用70μm的滤筛过滤，将滤液转移到培养瓶，并放入二氧化碳（CO2）细胞培养箱中培养，隔天换液。1.2.2MSF的鉴定采用形态学观察法观察MSF的形态特征；Vimentin蛋白采用细胞免疫组化法分析MSF，具体方法如下，将培养板中长好MSF的玻片用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定爬片15min，PBS清洗3次；0.5%TritonX⁃100室温通透20min；加滴一抗波形蛋白抗体。用PBS清洗，滴加生物素标记的二抗，PBS冲洗。滴加链亲和素⁃过氧化酶溶液孵育。DAB显色，用苏木素复染，用中性树胶封固，在显微镜下采集图像。1.2.3D⁃半乳糖诱导细胞衰老将生长状态良好的MSF接种于6孔板，用高糖DMEM培养基、37℃CO2培养箱培养。待细胞融合70%~80％，给予含有不同浓度D⁃半乳糖（10、20、30g/L）的完全培养基，分别培养0、24、48h。1.2.4β⁃半乳糖苷酶染色实验按照β⁃半乳糖苷酶染色试剂盒说明书进行实验操作，具体方法如下：吸弃旧的培养基，用DPBS清洗1次，加入1mL染色固定液，室温固定15min；吸弃固定液，用DPBS清洗3次，每次3min；吸弃DPBS，每孔加入1mL染色工作液，用保鲜膜盖住6孔板，然后放置于37℃恒温箱中孵育过夜。甘油封闭镜下观察，各组随机计数400个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞率（%）。1.2.5逆转录⁃聚合酶链反应（RT⁃PCR）法检测p53基因表达D⁃半乳糖（20g/L）分别诱导MSF0、24、48h，采用Trizol法提取细胞总RNA并进行RT⁃PCR，采用荧光定量染料法检测p53mRNA表达水平（上游引物：AGTCCTTTGCCCTGAACTGC，下游引物：GCGGATCTTGAGGGTGAAAT），每个样本重复测量3次，以GAPDH（上游引物：CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT，下游引物：AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC）为内参参照标准，按照2－△△Ct计算p53基因相对表达量。1.2.6细胞免疫荧光观察Sirt1基因在MSF中的表达D⁃半乳糖（20g/L）分别诱导MSF0、48h，将培养板中爬好MSF的玻片用PBS清洗3次，每次3min；4%多聚甲醛固定爬片15min，用PBS清洗3次，每次3min；0.5%TritonX⁃100室温通透20min；用PBS清洗3次，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清室温封闭30min；吸水纸吸掉封闭液，并滴入足量稀释好的一抗小鼠单克隆抗体Sirt1，放入湿盒，在4℃孵育过夜；用PBST浸洗爬片3次，并吸干液体，滴入稀释好的荧光二抗，黑暗条件下20~37℃湿盒孵育1h，PBST洗3次，每次3min；滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，用PBST清洗；用含抗荧光淬灭剂的封片液封闭，在荧光显微镜下采集图像。1.3统计学处理所有实验均重复3次，计量资料以x±s表示，应用SPSS17.0统计软件进行数据分析。多组间比较应用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1倒置相差显微镜观察MSF形态学变化光镜下可见细胞胞体较大，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显，为多突的梭形或星形的扁平细胞，具有突起，符合皮肤MSF的形态学特征。见图1。2.2Vimentin蛋白免疫组织化学分析Vimentin蛋白免疫组织化学结果显示，原代培养细胞中Vimentin蛋白呈阳性表达。见图2。2.3β⁃半乳糖苷酶染色分析β⁃半乳糖苷酶染色后，A.第1天；B.第2天图1原代成纤维细胞形态及鉴定（4×）BAA.对照组；B.Vimentin组图2MSFVimentin蛋白免疫组化分析（4×）BA··3269