弓形虫病血清学诊断技术一、实验目的及要求掌握弓形虫病血清学诊断技术，通过对弓形虫的检测和鉴定，为防治和预防弓形虫病提供科学依据。

二、实验器材弓形虫虫株、小白鼠、恒温箱、离心机、血清、G3砂蕊漏斗、纤维素滤膜、试管、载玻片、盖玻片、显微镜、荧光显微镜、冰冻切片机、吸管、湿盒、微量血凝试验型V反应板、微量加样器、无菌试管、一次性灭菌注射器、冰箱、胶乳试验玻璃板、常规石蜡切片机、染色缸、水浴锅、微量加样仪、ELISA 板、等。

药品：生理盐水、胰酶、美蓝染液、PBS、弓形虫诊断制剂（IHA抗原）、碘酒、70%酒精、无菌生理盐水、5%柠檬酸钠、DAB、Tris盐酸、牛血清白蛋白(BSA)等。

三、实验方法步骤和操作要领。

弓形虫病血清学诊断技术主要有以下几种方法：（一）染色试验（Sabin—Feldman dye tese，DT）染色试验（Sabin—Feldman dye tese，DT）。

是弓形虫特有的血清学诊断法，此法特异性高而且被认为是标准的诊断方法。

其原理是活的弓形虫速殖子与正常血清混合，在37℃作用1h或室温数小时后，大部分滋养体由原来的新月形变为圆形或椭圆形，细胞质对碱性美蓝具有较强的亲和力而被深染。

但当弓形虫与含特异性抗体和补体(辅助因子accessoryfactor.AF)的血清混合时，虫体受到抗体和补体的协同作用而变性，对碱性美蓝不着色。

计算着色与不着色虫体比例即可判断结果。

1.辅助因子。

存在于正常人新鲜血清内，不耐热。

用作辅助因子的血清需预先筛选，即将候选血清与弓形虫速殖子混合，37℃作用1h后，有90％以上虫体经美蓝染色后，着色者即含有辅助因子（AF）。

含辅助因子血清可分装后于一2O℃保存备用。

2.抗原制备。

弓形虫速殖子经腹腔感染小鼠，3d后抽取腹腔液，生理盐水洗涤3次 (300Or/min×lOmin)，收集纯净虫体。

也可将小鼠腹腔悬液用胰酶消化，经G3砂蕊漏斗或纤维素滤膜过滤纯化，所获虫体用辅助因子血清稀释至每高倍视野50个左右虫体，即为抗原液。

3.美蓝染液。

美蓝10g加入95％乙醇溶液1OOml，滤纸过滤，取3ml加pHll的碱性缓冲液（O.53％Na2CO39.73ml，1.91％Na2B4O70.27ml）lOml。

碱性缓冲液临用前配制。

4.待检血清。

新鲜血清需经56℃30min灭活，或直接用生理盐水倍比稀释后，每管0.lm1,4℃中次日使用。

5.检测。

在稀释血清内每管加上述抗原悬液0.lml，37℃孵育1h，滴加美蓝染液0.O2ml/管，继续温育l5min后，自每管取悬液1滴涂片，加盖玻片镜检。

6.结果判定。

计算各管不着色虫体的百分比，以50％虫体不着色管的血清稀释度为该份被检血清的最高抗体滴度。

一般认为，抗体滴度1:8为隐性感染;1:956为活动性感染;1:1024以上为急性感染。

DT所测抗体是虫体表膜抗原诱导的特异性抗体。

本试验易与肉孢子虫抗血清发生交叉反应；操作中需用活虫；辅助因子血清筛选较烦琐。

（二）荧光抗体试验（FA）荧光抗体试验（FA）该技术将血清学的特异性和敏感性与显微技术的精确性结合起来，解决了生物学上的许多难题。

其原理是：用荧光素对抗原或抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。

1.直接荧光抗体试验。

（1）标本制备。

①切片制备。

取被检动物腹股沟淋巴结压印片，冷丙酮4℃固定10min。

②洗涤。

将固定好的压印片用0.01mol/LpH值7.2～7.4PBS漂洗，漂洗5次，每次3min，吹干。

（2）直接染色。

①在压印片上滴加用0.01mol/LpH值8.0PBS稀释的1：16的荧光标记的特异抗体。

②放于湿盒内，37℃经30min孵育。

③用0.01mol/LpH值7.2～7.4PBS漂洗，漂洗5次，每次3min，吹干。

④用0.01%伊文思兰液复染，在滴加后立即洗去，并吹干。

⑤载玻片上加缓冲甘油并覆以盖玻片封片。

⑥置荧光显微镜下立即观察。

⑦结果判定标准：+ + + + 黄绿色闪光荧光+ + + 黄绿色亮荧光+ + 黄绿色荧光较弱+ 仅有暗淡的荧光- 无荧光2.间接荧光抗体试验。

（1）标本制备。

①切片制备。

将冰冻的被检动物腹股沟淋巴结进行切片，冰冻切片置载玻片上，以—30℃丙酮4℃固定30min。

②洗涤。

将固定好的切片以PBS漂洗，漂洗5次，每次3min。

（2）间接染色。

①一抗作用。

在晾干的标本片上滴加弓形虫抗体，置湿盒，37℃作用30min。

②洗涤。

以吸管吸取PBS冲洗标本片上的弓形虫抗体，后置大量PBS中漂洗，共漂洗5次，每次3min。

③二抗染色。

滴加荧光抗体，置湿盒，37℃染色30min。

④洗涤。

以吸管吸取PBS冲洗标本片上的荧光抗体，后置大量PBS中漂洗，共漂洗5次，每次3min。

⑤晾干。

将标本片置晾片架上晾干。

⑥镜检。

将染色后的标本片置荧光显微镜下观察，先用低倍物镜选择适当的标本区，然后换高倍物镜观察。

以油镜观察时，可用缓冲甘油代替香柏油。

本试验应设以下对照：①自发荧光对照。

②已知阳性对照。

③已知阴性对照。

结果判定。

同上。

（三）间接血凝试验（IHA）(indirecthaemagglutinationtest,IHAAT)间接血凝试验（IHA）(indirecthaemagglutinationtest,IHAAT)亦称被动血凝试验，其操作简单、价格低廉、敏感性高、特异性强，宜作为辅助诊断、流行病学调查的方法。

反应原理是：将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集。

（1）弓形虫抗原的制备。

取小鼠，以碘酒和70%酒精消毒小鼠腹部皮肤，腹腔接种弓形虫速殖子，4d后乙醚麻醉或颈椎脱臼法处死小鼠，以碘酒和70%酒精消毒腹部皮肤，向腹腔内注入无菌生理盐水3～4m1，轻揉腹壁，再抽取腹腔液，2500rpm离心15min,倾去上清液，在沉淀中加10倍pH 7.2 PBS，振荡混匀，4℃过夜，10000rpm4℃离心1h，取上清液加等量1.7%盐水。

—20℃以下保存备用。

（2）绵羊红细胞的鞣化。

①绵羊红细胞的采集和处理。

以碘酒和70%酒精消毒健康绵羊颈部皮肤，用5m1的一次性灭菌注射器采集全血2～3m1，快速注入含有0.2～0.3 ml 5%柠檬酸钠的试管内，轻轻摇匀。

2000rpm离心l 0min，加入0.15M pH 7.2 PBS适量进行洗涤，2000rpm离心10min，再加入0.15M pH 7.2 PBS适量进行洗涤。

如此反复洗涤3次，用PBS配成2.5%的红细胞悬液。

②绵羊红细胞的鞣化。

在2.5%的红细胞悬液中加入含1%鞣酸的PBS使鞣酸的终浓度为1/10000或1/20000, 3 7℃水浴15min，用PBS洗涤3次，再加PBS配成2.5%鞣化红细胞。

（3）抗原致敏鞣化的绵羊红细胞。

将2.5%鞣化红细胞1份，抗原液1份，pH6.4的PBS液4份混合，摇匀后室温下放置15min，加1%正常兔血清后，2000rpm离心洗涤2次，再用PBS配成2.5%的红细胞悬液。

4℃下保存备存。

（4）待检血清的采集与处理。

取待检血清0.5ml置于试管中，加入1%正常兔血清1.5m.1，56℃灭活30min，加入未致敏的绵羊红细胞2m1，4℃过夜。

（5）间接红细胞凝集试验的操作步骤。

取处理后的待检血清作倍比稀释，于96孔“V”型反应板中每孔加入上述倍比稀释的待检血清50μl，然后加入致敏的绵羊红细胞悬液50μl，37℃作用2h以上，观察结果。

以1：64的稀释度出现50%凝集者判为阳性。

同时设立阳性对照和阴性对照。

（6）结果判定。

①红细胞呈膜状均匀沉于孔底，中央无沉点或沉点小如针尖，判为“++++”。

②红细胞呈膜状沉着，但颗粒较粗，中央沉点较大，判为“+++”。

③红细胞部分呈膜状沉着，周围有凝集团点，中央沉点大，判为“++”。

④红细胞沉集于中心，周围有少量颗粒状沉着物，判为“+”。

⑤红细胞沉集于中心，周围无沉着物，分界清楚，判为“一”。

⑥结果判定：以出现“一”孔的血清最高稀释倍数定为本间接血凝试验的凝集效价。

小于或等于1: 16判为阴性;1: 32判为可疑;等于或大于l: 64判为阳性。

兔血清要事先用绵羊红细胞吸收其非特异性凝集素；抗原致敏鞣化的绵羊红细胞，在六个月内有效。

（四）胶乳凝集试验（LA）胶乳凝集试验（LA）其原理是在特定条件下将寄生虫抗原与胶乳相连接，使成为颗粒型抗原。

这种抗原与寄生虫感染者血清中特异性抗体结合后，即形成抗原-抗体复合物，在有适当电解质存在的条件下，经过一定时间，胶乳颗粒即凝集在一起，显示肉眼可见的凝集团块，即为阳性反应，否则为阴性反应。

1．弓形虫抗原的制备。

（1）弓形虫腹水的制备。

小鼠是获得弓形虫最为满意的动物模型。

小鼠一般在感染速殖子后的4d左右因发病而死亡，此时速殖子大量繁殖并散在于腹腔液中，在其病死前处死，先注入1ml灭菌生理盐水，吸出腹腔液，再用生理盐水洗涤1～2次（有出血者弃去），这样可获得大量的速殖子。

一般认为感染后3d内收集腹水最为适宜，此时白细胞数较少，容易纯化。

（2）速殖子纯化方法。

①胰蛋白酶消化法。

将小鼠腹水3000rpm离心5min，弃上清，加入20倍量体积0.25%的胰蛋白酶消化液，37℃消化30min, PBS离心、洗涤3次，沉淀再重复消化洗涤1次，取滤液置于白细胞计数板上镜检，对弓形虫速殖子、白细胞进行计数。

②微孔滤膜过滤法。

将小鼠腹水3000rpm离心5min，弃上清，加入适量PBS，制成虫体悬液，将此悬液加入装有直径为3µm微孔滤膜的滤器，收集滤液，取滤液置于白细胞计数板上镜检，对弓形虫速殖子、白细胞进行计数。

③植物血凝素(PHA-P)法。

将小鼠腹水3000rpm离心5min，弃上清，加入适量PBS，制成虫体悬液，然后加入植物血凝素，使植物血凝素的终浓度为0.005%。

室温下放置30 min。

尼龙纱布过滤，取滤液置于白细胞计数板上镜检，对弓形虫速殖子、白细胞进行计数。

选择虫体回收率、白细胞清除率高以及非特异性可溶性蛋白少的纯化方法作为抗原纯化方法。

（3）弓形虫抗原的制备。

取纯净的弓形虫速殖子，加灭菌双蒸水，混匀，经超声波粉碎或反复冻融5次，经10000rpm离心30min，取上清液加等量1.7%NaCl溶液即为可溶性抗原。

2.胶乳及胶乳抗原制备。

（1）羧化聚苯乙烯胶乳及其衍生物的制备。

①羧化聚苯乙烯胶乳制备。

在苯乙烯的乳液聚合过程中加入丙烯酸单体，可获得带有羧基的聚苯乙烯胶乳。

各组分的重量比为:水/苯乙烯/丙烯酸=180/20/0.9，引发剂为过硫酸钾，乳化剂为10～14烷基苯基磺酸钠。

应用上述方法所制备的羧化胶乳的浓度约0.5%,它的直径为0.5～0.6µm，为较适宜的胶乳颗粒大小。