方法
本课题组前期工作应用微卫星多态性位点通过连锁分析和单倍型分析对４
例中国疑似ＸＬＲＰ家系的致病基因进行了定位分析并确定其中有３个家系为ＲＰ２或 ＲＰ３型ＸＬＲＰ家系。 本次研究主要分两部分阐述：第一部分首先阐述我们应用微卫星多态性位点对新 收集到的１例中国疑似ＸＬＲＰ家系进行基因定位分析，确定其致病基因位点。第二部 分阐述我们结合课题组前期成果，对基因定位基本判定为ＲＰ２型或ＲＰ３型ＸＬＲＰ的共 计３个家系及１０例疑似ｘＬＲＰ散发患者进行侯选基因ＲＰ２和ＲＰＧＲ的突变筛选，尤 其针对既是突变热点区又是测序困难区的外显子ＯＲＦｌ５进行相关的序列测定和基因 突变分析研究。 在第一部分基因定位分析中，我们应用微卫星多态性位点（根据ＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ６、 ＲＰ２３和ＲＰ２４位点的连锁定位信息，其中重点针对ＲＰ２和ＲＰ３共选取位点附近的１２ 个微卫星多态标记）用多点参数分析方法计算其最大优势对数值（ＬＯＤ ｓｃｏｒｅ），对新收集 到的１例疑为Ｘ连锁型视网膜色素变性家系进行遗传连锁分析和单倍型分析。 在第二部分的基因突变分析中，我们主要针对定位后的侯选基因ＲＰ２基因和 ＲＰＧＲ基因在视网膜中主要的选择性剪接产物ＲＰＧＲｏＲＦｌ５，尤其针对突变热点区外显 子０ＲＦｌ５进行相关的序列测定和基因突变分析研究。首先对全体男性患者的ＲＰ２基 因和ＲＰＧＲ基因进行序列测定，经比对后寻找突变位点，再针对其突变位点对其家系 成员进行该区域的序列测定以进一步确定突变与疾病共分离，并作出相关的家系突变 分析。 结果第一部分的基因定位分析结果：确定了ｚｓｃ家系致病基因的大致范围： ＲＰ２３或ＲＰ６基因，同时验证了该家系的ｘ性连锁遗传模式。 第二部分的基因突变分析结果：在对基因定位于ＲＰ２或ＲＰ３基因位点的３个ＸＬＲＰ 家系和１０例疑似ｘＬＲＰ的散发患者进行ＲＰ２基因和ＲＰＧＲ基因的测序比对分析后发 现，在ＲＰ２基因未发现有基因突变；在ＲＰＧＲ基因的１—１４号外显子及部分外显子的 侧翼内含子区域中发现了６个已有报道的ＳＮＰ多态性位点；在外显子ＯＲＦｌ５发现了 两个致病突变ｇ．０ＲＦｌ５＋４８３ｊ８４ｄｅｌＧＡ和ｇ．ＯＲＦｌ５＋８２ｌ一８２２ｄｅｌＧＧ（前者已有报道，后 者至今未见相关报道）、５个已有报道的多态性位点、５个至今未见报道的单碱基替换
第三军医大学硕士学位论文
我国Ｘ连锁型视网膜色素变性家系的基因连锁定位 及突变的分析研究
摘
背景
要
视网膜色素变性（Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ，ＲＰ）是一种常见的遗传性致盲眼病。
群体患病率在不同的种族人群中较为相似，约１／３５００４０００。在该病中，患者的视网膜 感光细胞和色素上皮细胞变性导致夜盲和进行性视野缺损。ＲＰ有多种、ｘ染色体连锁 遗传ＲＰ（ｘ一１ｉｎｋｅｄ
（ｇ．０ＲＦｌ５＋８９９
Ａ＞Ｔ、ｇ．ＯＲＦｌ５＋８９９ Ａ＞Ｇ、ｇ．ＯＲＦｌ５＋９８８
Ａ＞Ｇ、ｇ．ＯＲＦｌ５＋１０７２
Ａ＞Ｇ、
６
第三军医大学硕士学位论文
ｇ．０ＲＦｌ５＋１５１１
Ｇ＞Ａ）和１个未见报道的２１个碱基的重复（ｇ．ＯＲＦｌ５＋１１４９＿１１６９
ｄｕｐ
２１）。
两个致病突变ｇ．０ＲＦｌ５＋４８３＿４８４ｄｅｌＧＡ和ｇ．ＯＲＦｌ５＋８２１—８２２ｄｅｌＧＧ分别发现于 ｚＬＫ家系和ＸＹ家系，且与疾病呈现共分离。 结论本次研究应用微卫星多态性位点对新收集到的一例疑似ＸＬＲＰ家系进行了 基因定位分析。主要结合连锁分析和单倍型分析将其致病基因定位于ＲＰ２３或ＲＰ６， 进一步确定了该家系的ｘ性连锁遗传模式，初步判定该家系的女性携带者，从而为该 家系的女性亲属及其子女提供了该病的基因诊断和遗传咨询。 对课题组前期工作中已确定为ＲＰ２型或ＲＰ３型的３例ＸＬＲＰ家系全部患者以及疑 似ＸＬＲＰ的１０个散发患者进行了ＲＰ２和ＲＰＧＲ基因的序列测定以寻找相关致病突变 和探索ＳＮＰ多态性位点。我们找到了两个家系的致病突变，其中一个致病突变为首次 报道；另外还发现了１７个多态性位点，其中有６个为首次报道，丰富了人类ｘＬＲＰ 疾病的突变谱。此外，从突变发生区域来看，两个致病突变和１７个多态性位点中的 １１个均存在于外显子０ＲＦｌ５，这就很好地表明：外显子０ＲＦｌ５不仅在英国、北美、 德国及曰本等地是ＲＰＧＲ基因中的一个突变热点区，在我们所研究的中国人群中也是 一个突变热点区。 针对所发现的突变，我们对其进行了相关的功能预测和氨基酸编码改变的推测， 推测致病突变引起氨基酸移码突变后提前终止编码，生成～段缺失进化保守功能域的 截短蛋白。怀疑截短蛋白的生成与疾病的发生有密切的关系。对ＲＰＧＲ基因及其功能 有了更深一步的认识。 通过本次研究，我们还建立了对突变热点区同时也是测序困难区的外显子ＯＲＦｌ５ 的一整套测序的策略和方法，为后续的该疾病的分子遗传学研究奠定了良好的基础。
基因定位分析，进一步确定家系的ｘ性连锁遗传模式，初步判定该家系的女性携带者， 为该家系的女性亲属及其子女提供该病的基因诊断和遗传咨询。 对在课题组前期工作中经基因定位基本判定为ＲＰ２型或ＲＰ３型ＸＬＲＰ的家系及新
第三军医大学硕十学位论文
收集到的疑似ＸＬＲＰ的１０例散发患者进行ＲＰ２基因和ＲＰ３基因的突变的筛选和检测， 以寻找相关致病突变和ＳＮＰ多态性位点。通过基因突变的分析研究，了解我国ＸＬＲＰ 患者的基因突变状况，并提供更多的有关基因型和表型相关联的数据。
ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ
ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ，ＸＬＲＰ）及线粒体连锁遗传ＲＰ。其中ｘＬＲＰ约占所
有ＲＰ患者的６—２０％，患者发病年龄早、损害最为严重、预后甚差，是青少年致盲的 常见原因之一，目前已在Ｘ染色体上定位了６个与ＸＬＲＰ相关的基因位点，分别是： ＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ６、ＲＰ２３、ＲＰ２４和最近新定位的ＲＰ３４。其中已被先后成功克隆的有两 个基因：ＲＰ２和ＲＰ３。家系连锁分析表明约ｌＯ％一２０％的ＸＬＲＰ与位点ＲＰ２连锁，约 ７０％一８０％的ｘＬＲＰ与位点ＲＰ３连锁。这表明ＲＰ２基因和ＲＰ３基因是ｘＬＲＰ的主要致 病基因。 ＲＰ３基因又名ＲＰＧＲ基因，它在不同的组织细胞中有不同的选择性剪接产物，其 中在视网膜细胞中以ＲＰＧＲｏＲＦｌ５转录子为主。该转录子包括原来确定的ＲＰＧＲ的１９ 个外显子的前１４个外显子和外显子ＯＲＦｌ５（原外显子１５和部分内含子１５的区域）。近 年来在英国、北美、德国及日本等地人群的研究表明，外显子ＯＲＦｌ５是ＸＬＲＰ的一个 突变热点区，约６０％一８０％的ＸＬＲＰ患者在该外显子内都存在致病突变。同时在这个长 达１７０６ｂｐ的序列中，包含了一段至少ｌｏｏＯｂｐ的ＡＧ高度重复的嘌呤区，使得对该区 域的测序无论是在引物设计上还是在延伸过程中都变得异常困难。 目前有关ｘＬＲＰ的分子遗传学研究仍主要集中在白种人群，亚洲人群的报道则主 要来自于日本，而有关中国人ＸＬＲＰ相关基因突变的系统研究还未见报道，只有一些 零散家系的个案报道，且突变筛选的范围很少涉及到外显子ＯＲＦｌ５的难测区域。 目的 通过连锁分析和单倍型分析的方法对一例新收集到的ＸＬＲＰ家系进行致病