摘要

本发明一种羧基化法β-环糊精修饰的低毒性功能化量子点及其制备方法，属于特异性分子识别诊断试剂领域。本发明通过化学修饰方法在β-环糊精上连接功能基团羧基，得到羧基-β-环糊精；在1-乙基-3-（3-二甲基丙胺）碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的作用下，叶酸经活化后先与双氨基聚乙二醇偶联，再与羧基-β-环糊精偶联，得到叶酸-β-环糊精；利用银，锌等低毒性元素作为原料，制备油溶性的近红外量子点，并用叶酸-β-环糊精对其进行水溶性的修饰，得到羧基化法β-环糊精修饰的低毒性功能化量子点。本发明制备的量子点具有良好的水溶性，低毒性，发射光谱在近红外区，并且由于偶联了叶酸，可以用于肿瘤的特异性荧光检测。

说明

一种羧基化法β-环糊精修饰的低毒性功能化量子点及其制备方法

技术领域

[0001] 一种羧基化法β -环糊精修饰的低毒性功能化量子点及其制备方法，制备的功能化量子点可以用于肿瘤标志物等的特异性荧光检测，属于特异性分子识别诊断试剂领域。

背景技术

[0002] 叶酸是细胞(尤其是增殖旺盛的细胞)所必需的维生素，它参与多种代谢途径的一碳转移反应。叶酸的细胞转运通过两种跨膜蛋白，即低亲和力的还原性叶酸载体和高亲和力的叶酸受体来完成。目前已证实叶酸受体在多种肿瘤细胞表面过度表达，如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌、脑瘤、室管膜细胞瘤等，而在多数正常组织中的表达仅限于一些难于进入血液循环的上皮细胞顶膜。叶酸含有α和Y两个羧基，易于修饰，同时具有低免疫原性、小体积、高化学稳定性和生物学稳定性，高肿瘤渗透性、易与药物结合，与有机或水性溶剂的相容性佳以及低成本等优点，故叶酸介导的肿瘤靶向研究得到了迅速发展。

[0003] 用于生物分子和细胞标记与识别的荧光探针包括有机分子荧光探针和无机分子荧光探针两类。有机分子荧光探针的种类尽管比较多，但存在着Stoke位移小，容易光漂白以及量子产率低等不足。无机分子突光探针主要是量子点(Quantum Dots,QDs)。QDs是指半径小于或接近于激子波尔半径的半导体纳米晶粒，粒径通常为Ι-lOnm，一般为由I1-VI族或II1-V族元素构成的化合物。量子点作为一种新型荧光染料，具有很多独特而优良的光学特性，包括(I)连续而宽的激发光谱，且荧光谱峰位置可通过改变QDs的粒径进行调控，这样仅用一种波长的激发光源便可激发多种不同颜色荧光的QDs，进行多元荧光检测。(2)发射光谱窄，可同时显现多种不同颜色而无重叠。(3)Stokes位移大，能够避免发射谱与激发谱重叠，从而允许在低信号强度的情况下进行光谱学检测。(4)抗光漂白能力强，而这种抗光漂白的高度光稳定性对于需要长时间成像的研究而言极为重要。(5)光稳定性高，便于获得无背景干扰的荧光信号等优良的光物理特性。(6)荧光产率高，强度强，单一量子点表现出的荧光亮度是有机荧光染料的10-20倍。因此，量子点在多个研究领域显示出其独特的应用前景。

[0004] 根据合成量子点时所采用溶剂的不同，量子点合成方法可归结为两大类

一种方法是在高沸点的有机溶剂中利用前躯体热分解来合成，得到的产物荧光效率高、尺寸均匀、稳定性好。另一种是利用稳定剂在水溶液中直接合成，产物的尺寸分布宽，荧光效率较低。一般

量子点的合成是在有机溶剂中进行的，在非金属核的外面形成了疏水性的外壳，使得合成的量子点具有疏水性而不能在生物学上应用。为了使它们具有生物相容性，常对它们进行功能化，或对其进行第二层包被，可以增强其水溶性、核的持久稳定性以及悬浮性质，使量子点具有更好的生物活性。

[0005] 通过修饰量子点的包被可以得到高度 特异性的量子点，用于诊断(分子成像)和治疗(生物载体)等。但是它们的潜在毒性就在于它们的包被上，如果这些包被脱离核，不管释放出组合体的核(CdTe、CdSe)还是单一的金属镉(Cd)，都会产生毒性。或者，一些量子点包被材料本身就有细胞毒性，如醋酸甲醇(MAA)。同时，在光照和氧化条件下量子点可能降解，因此稳定性在其商业化进程中显得至关重要。

[0006] 近红外荧光探针在生物体内分子的诊断识别中起着关键的作用。因为近红外波段(60(T800nm)的光波避开了体内水，有氧及无氧血红蛋白等主要吸收组织的最佳吸收波长，因而具有良好的生物组织穿透能力，且对生物组织无损伤。因此具有近红外发光特性的水溶性量子点更适合生物分析应用。

[0007] 环糊精(Cyclodextrin，简称⑶)是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6〜12个D-吡喃葡萄糖单元。其中研究得较多并且具有重要实际意义的是含有6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为α-、β-、Y-环糊精。根据X-线晶体衍射、红外光谱和核磁共振波谱分析的结果，确定构成环糊精分子的每个D(+)-吡喃葡萄糖都是椅式构象。各葡萄糖单元均以1，4_糖苷键结合成环。由于连接葡萄糖单元的糖苷键不能自由旋转，环糊精不是圆筒状分子结构而是略呈锥形的圆环。其中，环糊精的伯羟基围成了锥形的小口，而其仲羟基围成了锥形的大口。形成略呈锥形的中空圆筒立体环状结构。β-环糊精(β -⑶)分子结构如下式所示:

[0008]

[0009] 由于环糊精的外缘亲水而内腔疏水，因而它能够象酶一样提供一个疏水的结合部位，作为主体(Host)包络各种适当的客体(Guest)，如有机分子、无机离子以及气体分子等。在三种环

糊精中，由于α-⑶分子空洞孔隙较小，通常只能包接较小分子的客体物质，应用范围较小；Y -CD的分子空洞大，但其生产成本高，工业上不能大量生产，其应用受到限制；β-CD的分子空洞适中，应用范围广，生产成本低，是目前工业上使用最多的环糊精

根据β_环糊精的结构特点，可以对其结构上的伯羟基或仲羟基的氢原子进行取代，或者取代伯羟基或/和仲羟基，或消除6-位碳原子上的氢原子，通过部分氧化打开一个或者更多个C2-C3单键。通过化学修饰的方法，将氨基、羧基等水溶性基团引入到β-CD，可以极大改善它的性质，从而扩大使用范围。

[0011] 叶酸是核酸生物合成所必需的维生素，尤其是对增生细胞。叶酸的细胞转运是通过两种跨膜蛋白即低亲和力的还原型叶酸载体和高亲和力的叶酸受体(FR)。已证实FR在多种肿瘤细胞过度表达，当叶酸摄入量受限时，肿瘤细胞摄取叶酸的能力要强得多。且FR在多数新生正常组织中的表达仅限于一些难于进入血液循环的上皮细胞顶膜。正因为FR表达的特性，比如具有高亲和力(Kd=I(TltW)I.L—1)，低免疫原性，易于修饰，体积小(Mr=441.4)，高度化学稳定性和生物学稳定性，与有机溶剂的生理相容性，低成本等优点使叶酸介导靶向肿瘤的研究得到迅速发展。叶酸的化学名称为N-(4-((2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶)甲氨基)苯甲酰基)-L-谷氨酸，含有α和Y两个羧基，实验证明通过叶酸的Y-羧基衍生的偶联物具有与叶酸受体较高的结合能力。

[0012] 将叶酸溶解于适量无水二甲基亚砜(DMSO)中，加入1-乙基-3-(3-二甲基丙胺)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后，滴入到溶解在无水DMSO中连接了羧基的β -环糊精在室温下反应2Γ36小时，可以得到叶酸-β -环糊精偶联产物。

[0013] 偶联了叶酸的环糊精具有良好的水溶性，利用它来对近红外发射的量子点进行修饰，不仅可以改善量子点的水溶性，增加与生物体的相容性，而且由于叶酸在多种肿瘤细胞中过度表达，量子点近红外发射的特性可以避开紫外光对生物体的损伤，并可以深入到生物体内部，所以修饰后的量子点可以作为肿瘤细胞的探针应用。

发明内容

[0014] 本发明的目的:本发明羧基化法β_环糊精修饰的低毒性功能化量子点是为了改善量子点的生物相容性，降低其生物毒性，同时提高其作为近红外荧光探针对肿瘤标志物检测的灵敏度。

[0015] 本发明的技术方案:一种羧基化法β -环糊精修饰的低毒性功能化量子点，由β -环糊精通过化学方法连接上羧基，再进一步与叶酸偶联形成叶酸-β -环糊精；所述量子点为低毒性功能化量子点，组 成低毒性功能化量子点的元素为银、锌和铟；该量子点通过叶酸-β -环糊精修饰得到β-环糊精修饰的低毒性功能化量子点；

[0016] 该环糊精修饰的低毒性功能化量子点的组成为银离子:铟离子:锌离子:NaS2CN(C2H5)2:叶酸-β -环糊精的摩尔比为 0.9-0.95: 0.9-0.95: 0.1-0.2:

3.5_4.5: 4-6 0

[0017] 所述羧基化法β -环糊精修饰的低毒性功能化量子点的制备方法，其特征在于步骤如下:

[0018] (I)羧基环糊精的制备

[0019] 在容器中加入4.5-5.5mmol的β -环糊精和55_65mL去离子水,在磁力搅拌情况下加入8-10mmol KOH使β-环糊精全部溶解。逐渐升温至45_55°C,加入9-llmmol羧基化试剂，连续搅拌条件下升温至85-95°C并保持I小时，然后停止加热；待反应体系冷却至室温后，用稀硫酸调节反应体系的pH为5-6,加入100-200mL无水乙醇,利用中性氧化招柱进行纯化层析，采用55%-65%乙醇作为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩洗脱液后真空干燥，得到羧基-β-环糊精；

[0020] (2)羧基_β -环糊精与叶酸的偶联制备叶酸-环糊精

[0021] a、叶酸的活化:在容器中加入4.5-5.5mmol叶酸并溶解在ll_13mL无水二甲基亚砜中，在不断搅拌条件下加入5.5-6.5mmol 1-乙基-3- (3-二甲基丙胺)碳二亚胺盐酸盐和5.5-6.5mmol N-羟基琥珀酰亚胺活化反应4小时；

[0022] 将活化后的叶酸滴加到含有180_220mg的双氨基聚乙二醇的无水二甲基亚砜溶液中，避光条件下反应10小时，然后通过硅胶柱层析的方法纯化，获得叶酸-聚乙二醇偶联物；

[0023] b、叶酸-聚乙二醇偶联物与羧甲基-环糊精的偶联

[0024] 在45-55mL无水二甲基亚砜溶液中加入1.8-2.2 mmol步骤(I)制备的羧基-β -环糊精,溶解后加入1.8-2.2mmol 1-乙基-3- (3- 二甲基丙胺)碳二亚胺盐酸盐和

1.8-2.2mmol N-羟基琥珀酰亚胺活化反应6小时，然后将活化液滴加到上述含有叶酸-聚乙二醇偶联物的缓冲液中，避光条件下反应24小时；反应的粗产物通过硅胶柱层析的方法纯化，获得叶酸-β-环糊精；

[0025] (3)量子点的制备

[0026] a、前驱体的制备:将 0.9-0.95mmoI AgN03、0.9-0.9Smmol In (NO3) 3、0.1-0.2mmolZn(NO3)2溶于3-5mL的去离子水中，再将3.5-4.5mmol NaS2CN(C2H5)2溶于2.5-7.5去离子水溶液中，两者混合后磁力搅拌20-40min除去其中的水分，并依次用10_14mL的去离子水和8-12mL甲醇洗涤，得到量子点前驱体二乙基二硫代氨基甲酸盐；

[0027] b、油溶性量子点的制备:在氮气保护条件下将步骤a所得量子点前驱体二乙基二硫代氨基甲酸盐缓慢加热至170-180°C，并保持该温度40-60min，然后向其中加入2_4mL油胺,继续加热2-4min后停止加热，并逐渐冷却至室温；

[0028] c、量子点的纯化处理:将步骤b所得油溶性量子点在500_2500r/min离心2-5min，取上清液，向其中加入8_12mL甲醇，搅拌l_5min后用真空抽滤方式得到纯化的量子点；

[0029] (4)量子点的功 能化修饰

[0030] 取步骤(3)所得的纯化量子点溶于1.5-8.5mL三氯甲烷溶液中，步骤(2)所得叶酸-β -环糊精溶于1.5-6.5mL去离子水中，混合后搅拌3_10min, 500-2500r/min离心,取水层即得产物羧基化法β-环糊精修饰的低毒性功能化量子点。