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赖氨酸的发酵调控研究
一、实验目的
1、 了解赖氨酸发酵常用的发酵菌种。
2、 掌握L-赖氨酸发酵的工艺控制过程和方法。
3、 能熟练运用发酵过程的基本原理，根据实验的不同要求，正确的设计实验方
案，并按照实验方案进行实验研究
二、实验原理
赖氨酸的生产方法有水解法(已淘汰)、合成法、酶法和直接发酵法。直接发
酵法合成的赖氨酸是一种次级代谢产物。微生物合成赖氨酸是诱导物的诱导调
节、自身产物的反馈调节、自身产物的分解调节、以及细胞膜透性的调节等次级
代谢调节综合作用的结果。谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调节作用如图1
所示。
图1 谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调节作用
天冬氨酸
天冬氨酰磷酸
天冬氨酸半醛
双氢吡啶羧酸 丝氨酸
苏氨酸
异亮氨酸
甲硫氨酸
赖氨酸
高丝氨酸脱氢酶 苏氨酸与赖氨酸的协同反馈
抑制作
用
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三、材料与分析方法
1、 菌种
谷氨酸棒杆菌（编号10065，中国微生物菌种保藏管理中心）。
2、 培养基
（1）斜面培养基：牛肉膏1.1%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，
琼脂0.2%，pH7.0，在0.1Mpa压力下灭菌20min。
（2）种子培养基：糖蜜2.0%，豆饼水解液0.5%，(NH4)2SO4 0.4%，CaCO3
0.5%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.04%，pH7.0,，于250mL三角瓶内装25mL种子
培养基, 在0.1Mpa压力下灭菌20min。
（3）发酵培养基：糖蜜20%，豆饼水解液1.0%，玉米浆（氮源）0.6%，(NH4)2
SO4 2%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.05%，FeSO4 0.2%，MnSO4 0.2%，pH7.0，于
250mL三角瓶装液25mL发酵液，在0.1Mpa压力灭菌20min。
3、分析方法
（1）丝氨酸的测定
采用变色酸-分光光度法测定（见附录1）。
（2）赖氨酸的测定
发酵液中赖氨酸含量的测定采用茚三酮比色法，并加以改进。吸取发酵液
4mL, 6000r/min离心10min去菌体及杂质。取上清液2mL，加茚三酮试剂（A液：
茚三酮1.25g溶于94mL乙二醇甲醚中；B液：CuCl2·2H2O 1.97g溶于32mL
0.1mol/L柠檬酸溶液中；将A、B两液混合，用蒸馏水定容到250mL）4mL， 混
合，在沸水浴加热20min，冷却后测定475nm处的吸光度值，通过查赖氨酸标准
曲线得知发酵液中赖氨酸的浓度。
（3）菌体形态观察、菌种培养特性和菌种主要生理生化特性检查
参照《工业微生物试验技术手册》的方法.。
（4）高丝氨酸脱氢酶活力的测定
从图1 可知，天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的作用下可以转化为丝氨酸，
因此，本实验以一定反应条件下，单位时间内生成的丝氨酸的量所需的酶作为一
个酶活力单位（U）1U=1ug/min。
①粗酶液的制备
取5ml发酵液5500g离心15min，用pH 7.5的0.25mmol的Tris-HCL缓冲液
洗涤两次，超声波破碎10min，10000g离心15min得上清液即为粗酶提取液；
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②取粗酶液和1.0mg/ml的天冬氨酸半醛按1:1的比例混合，32℃水浴保温
5min，转入100℃的水浴终止反应1min，取1ml按丝氨酸的含量测定法进行测
定。（关于酶与底物反应的量要进行试验调整，以上仅供参考）。
四、试验方法与步骤
1、将活化的斜面培养菌接种于种子培养基中，置于往复摇床上30℃振荡培养
24h，得到种子培养物。
2、将种子培养物调整为64×107个菌体/mL的种子培养液。按1∶10的接种量将
种子培养液接种于发酵培养基中，在30±2℃、pH7.0～7.2条件下发酵72h。
五、结果与分析
1、该发酵菌种的生长特性，绘制菌种生长及代谢产物形成与培养时间的特征曲
线；
2、构建该菌种在最佳发酵条件下的细胞生长、底物利用和产物形成动力学模型；
3、找出该菌株发酵生产赖氨酸的主要影响因素，确定调控措施，确定其最佳发
酵条件。
附录
丝氨酸含量的测定方法
1、标准曲线的制作
分别精密吸取1.0mg/mL的丝氨酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL
于10 mL刻度试管中，滴一滴甲基红试液（取0.1g甲基红溶于100mL95%乙醇
中），加1.0mol·L–1的NaOH溶液使之刚呈碱性，再加0.075mol·L -1 NaIO4溶液
1.0 mL；10 min后，滴加10%三氯乙酸溶液使呈酸性，再加入10%的NaHSO
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溶液1.0 mL并补加水至10.0 mL，摇匀，取2.0 mL于10mL具塞离心管中，加
变色酸试剂（取变色酸50 mg溶于100 mL体积分数75%硫酸中）2.0 mL，加塞
混匀后于沸水浴中保温30min，取出，冷却至室温，加半饱和硫脲溶液(在20度
温度下，称取超过137克的硫脲，加入1000ml蒸馏水中，充分搅拌，使其充分
溶解。过滤后去除滤渣，所得到的溶液即为饱和溶液)0.5mL，摇匀。用分光光度
计测量反应产物在波长570nm处的吸光度。将吸光度对浓度进行直线回归，得
丝氨酸标准曲线方程。
2、样品测定
将待测氨基酸样品溶液适当稀释后，准确吸取一定体积的样品稀释液，按照
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标准曲线绘制的方法测定吸光度，从标准曲线上查得丝氨酸的质量浓度。
底物还原糖含量的测定
1实验原理
在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原
生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，
在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样
品中的含糖量。
2试剂
3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后
移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，
摇匀，冷却后定容至1000mL。
葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以
蒸馏水定容至100mL，即含葡萄糖为2.0mg/mL。
3操作方法
葡萄糖标准曲线制作
取6支1. 5 cmm×1.5cm试管，按下表加入2.0mg/mL葡萄糖标准液和蒸馏水。
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管号 葡萄糖标准液（mL） 蒸馏水(mL) 葡萄糖含量(mg/mL) A540
0 0 1 0
1 0.2 0.8 0.4
2 0.4 0.6 0.8
3 0.6 0.4 1.2
4 0.8 0.2 1.6
5 1 0 2
在上述试管中分别加入DNS试剂2.0mL，于沸水浴中加热2min进行显色，取出
后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0mL，摇匀，在540nm波长处测定光吸
收值。以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
4样品测定
将待测还原糖样品溶液适当稀释后，准确吸取一定体积的样品稀释液，按照
标准曲线绘制的方法测定吸光度，从标准曲线上查得还原糖的质量浓度。
谷氨酸棒杆菌菌体生长量的测定
每隔一定时间取样,测定菌液的光密度值(OD620) ，已未接种的培养基作为
参比溶液，绘制菌体生长状况曲线。
种子培养基细菌计数
挑取已活化的单菌落接种于种子培养基中，30℃，120r/min摇床振荡过液培
养，大概18小时；培养过程中取菌液测量菌体数，测量方法如下：
①在白纸上画1cm的正方形，将玻片置于其上；
②用微量注射器去10ul的菌液，用接种针涂抹均匀，保持在正方形区域内，待
干；
③置于试管架上，在水蒸气上固定5min，待干；
④滴一滴美蓝染液染色2min，用滤纸戏去多余的染液，待干；
⑤用水洗去多余的染液，待干，并用油镜镜检，记录30~50个视野，细菌数=30~50
个视野细菌数/（30~50）*500000,细菌数的数量级在107~108即可
赖氨酸的发酵调控研究的可能研究点
1） 不同的碳氮源对赖氨酸发酵的影响；
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2）改变细胞膜的通透性如添加生物素，钙离子，以及一些金属离子如锰
离子，镁离子等对赖氨酸产量的影响；
3）寻找对高丝氨酸脱氢酶酶活的影响的因素从而对赖氨酸发酵的影响；
4）添加合成途径的中间代谢物对赖氨酸的影响如添加天冬氨酸半醛、异
亮氨酸，蛋氨酸结构类似物甲基蛋氨酸，酸酸结构类似物α-氨基-β
-羟基戊酸等；