第31卷第9期2013年9月中华中医药学刊CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEVol．31No．9Sep．2013
中华中医药
学刊
多倍体与八倍体半夏中草酸钙晶体含量的测定潘平，李伟平，鲁光耀，吕迪，蒋福升，丁志山（浙江中医药大学，浙江杭州310053）
摘要：目的：测定多倍体（十六倍体）半夏和八倍体半夏原球茎以及块茎中草酸钙晶体的含量。方法：采用高效液相色谱法，以0．5%磷酸水溶液为流动相，以草酸为对照品，测定多倍体半夏和八倍体半夏中草酸钙晶体的含量。结果：多倍体半夏原球茎和块茎中草酸钙晶体的含量分别为（2．799±0．017）%和（1．375±0．037）%，八倍体半夏原球茎和块茎中草酸钙晶体含量分为为（1．136±0．028）%和（1．924±0．05）%。结论：半夏原球茎和块茎中均含有较高含量的草酸钙晶体，与八倍体半夏相比，多倍体半夏块茎中的草酸钙晶体明显比八倍体半夏低。关键词：半夏；草酸钙晶体；多倍体；八倍体；HPLC中图分类号：R284．1文献标志码：A文章编号：1673－7717（2013）09－1985－03
ContentDeterminationofCalciumOxalateinOctoploidandPolyploidPinelliaPANPing，LIWeiping，LUGuangyao，LYUDi，JIANGFusheng，DINGZhishan（ZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310053，Zhejiang，China）
Abstract：Objective：TodeterminethecontentofCalciumOxalateinprotocormandtuberofoctoploidandpolyploid（hexadecaploid）Pinellia．Methods：TodeterminethecontentofCalciumOxalateinoctoploidandpolyploidPinelliabyHPLCmethodwith0．5%PhosphoricAcidasmobilephaseandoxalicacidasstandardpreparation．Results：ThecontentofCalciumOxalateinprotocormofpolyploidPinelliawas（2．799±0．017）%while（1．375±0．037）%intubers，therewere（1．136±0．028）%CalciumOxalateinprotocormofoctoploidPinelliawhile（1．924±0．05）%intubers．Conclu-sion：ThereishighcontentofCalciumOxalateinprotocormandtuberofPinellia，comparedwithoctoploidPinellia，thetu-bersofpolyploidPinelliahaslowestcontentofCalciumOxalate．Keywords：Pinellia；CalciumOxalate；octoploid；polyploid；HPLC
收稿日期：2013－04－18基金项目：浙江省中医药科技计划项目（2013AZ031）；浙江省大学生科技成果推广项目（2010R410041）作者简介：潘平（1992－），女，浙江杭州人，本科学生，研究方向：中药资源开发与利用。通讯作者：丁志山（1967－），男，山东人，教授，研究方向：中药生物技术。E-mail：zjtcmdzs@163．com。
半夏是天南星科植物半夏Pinelliaternatat（Thunb．）Breit．的干燥块茎，辛、温；有毒。归脾、胃、肺经，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结等功效。广泛用于治疗湿痰寒痰，咳喘痰多，痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛，呕吐反胃，胸脘痞闷，梅核气等证；外治痈肿痰核［1］。近年来，半夏在止咳镇痛、抗肿瘤、抗菌等药理作用方面的研究报道不断增加，成为研究的热点，药理实验研究结果表明半夏可能有更广的开发应用前景［2］。但是生半夏有强烈的毒性［3］，是28种毒性中药之一，具有“戟人咽”的刺激性，能刺激声带黏膜，引起发炎水肿甚至失音，刺激消化道黏膜而引起呕吐或腹泻，刺激咽喉导致失音等不良反应［4］。因此有必要加强对半夏安全性的控制。本项目组在前期的试验中，成功诱导出了多倍体（十六倍体）半夏品种，该品种能大大提高半夏的产量，但是，目前尚未对该品种半夏毒性成分进行系统的研究，也没有对半夏原球茎中草酸钙晶体含量测定的报道。草酸钙晶体是天南星科植物主要的毒性成分［5］，本研究采用HPLC法对多倍体半夏以及普通半夏（即八倍体半夏）原球茎和块茎中毒性成分草酸钙晶体的含量进行了测定，以便为半夏多倍体品种的安全应用及其产业的开发和进一步的研究提供借鉴。1实验材料和试剂
1．1试药
MS粉培养基（BR，上海宇涵生物科技有限公司，批号
110412）；琼脂粉（BR，国药集团化学试剂有限公司，批号
F20091119）；6－苄基嘌呤（AR，上海伯奥生物科技有限公
司，批号080116）；1－萘乙酸（AR，中国医药（集团）上海化学试剂公司，批号F20020528）；2，4－二氯苯氧乙酸（AR，上海试四赫维化工有限公司，批号080401）；肌醇（AR，上海康捷生物科技发展有限公司，批号110901）；草酸（AR，国药集团化学试剂有限公司，批号T20071015，纯度HPLC≥98%）；甲醇（GR，天津赛孚瑞科技有限公司，批号20120518001）。1．2仪器
SW－CJ－2FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公
司）；LDZX立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英谷予华仪器厂）；
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中华中医药
学刊
SENCOR－201旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公
司）；AR2130电子精密天平（OhausCorp．PineBrook，Nj，USA）；DGG－9070A电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验
仪器有限公司）；PHS－3C型PH计（上海精密科学仪器有限公司）；Ultimate3000高效液相色谱仪系统（戴安中国有限公司）。多倍体与八倍体半夏均采自江山宝珠农业有限公司中药材GAP基地，一年生，经浙江中医药大学中药学博士丁志山教授鉴定为天南星科植物半夏（Pinelliaternatat（Thunb．）Breit）。2方法与结果
2．1半夏原球茎的诱导
分别取多倍体半夏和八倍体半夏叶片或者叶柄，接入MS+1．0mg/L6－BA+0．2mg/LNAA的培养基中，待形
成愈伤组织后，将愈伤组织转接至半夏原球茎诱导培养基中（MS+0．5mg/L6－BA+0．5mg/LKT+1．5mg/L2，4－D），在培养温度（25±2）℃，光照度2000～2500lx，光照
12h/d的条件下培养30d，即可观察到原球茎的形成。2．2供试品溶液的制备
分别将多倍体半夏原球茎和块茎，八倍体半夏原球茎和块茎干燥至恒重，打粉，过60目筛，每种样品粉末均取0．2g，精密称定，加入15倍量的蒸馏水，70℃水浴10min，过滤，弃去上清液，残渣用热水洗涤两次，然后用15倍量的0．1mol/L的HCl超声提取3次，过滤，合并3次滤液，用
0．1mol/L的HCl定容至10mL，即为供试品溶液。2．3对照品溶液的配制
取草酸对照品粉末15mg，精密成定，用适量的蒸馏水溶解后，定容至50mL，然后精密吸取10mL，用蒸馏水定容至50mL，即得0．06mg/mL的草酸对照品溶液，4℃保存备用。2．4系统适应性考察
戴安Acclaim120C18色谱柱（250mm×4．6mm，5μm）；流动相：0．5%磷酸水溶液（用精密pH计测定，pH为2．3）；检测波长210nm，流速1．0mL/min，柱温28℃。在此条件下，供试品溶液中草酸钙的峰与其他峰分
离度R＞1．5，达到基线分离，对照品溶液与供试品溶液中草酸钙的出峰时间在4min左右，具体见图1。从图中可以看出，草酸对照品、多倍体半夏块茎，八倍体半夏块茎，多倍体半夏原球茎和八倍体半夏原球茎的出峰时间分别为4．008min，4．06min，4．00min，4．08min和4．07min，所有样品和对照品的理论塔板数n均大于
2000，符合含量测定的要求。
1～5分别表示多倍体半夏块茎，八倍体半夏块茎，多倍体半夏
原球茎和八倍体半夏原球茎，草酸对照品。图1样品和对照品HPLC图2．5标准曲线的制备
取0．06mg/mL的草酸对照品溶液，按照上述的色谱条件，分别进样20、40、60、80和100μL，测定峰面积，以对照品的量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果发现，进样量与峰面积成正比（见下表），草酸在1．2～6．0μg的范围内线性关系良好，标准曲线方程，见图2。为Y=13．164X－1．3356，相关系数r=0．999，符合相关的要求。表1标准曲线结果进样量（μL）20406080100
峰面积14．456±1．01031．128±0．89245．481±2．01260．418±0．67278．797±1．2312．6方法学考察
2．6．1精密度考察取同一样品，每次进样10μL，重复
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