建立模型方法
急性肝功能衰竭模型： a. 腹腔注射法：采用Wistar 或SD大鼠，重 200±10g，约20只大鼠。实验组：用四氯化碳 (CCl4 ) 溶于精致植物油, 配成浓度为10%、 20%或更高40%的四氯化碳 ，予3-10ml/kg分 组腹腔注射给药，12～24h（更早或更晚）后 处死动物。取材，检测指标。 对照组：予相同 剂量的精致植物油腹腔注射，余同上。 b.皮下注射法：颈背部或后肢外侧皮下注射， 拔针是要注意药液外漏。 c.灌胃染毒法：试验前对动物隔夜禁食。
四氯化碳性肝损伤的机制
1 引起氧化应激 氧化应激在CCl4 引发肝 损伤的早期发挥着重要作用。 (1)引起自由基变化; (2) 引发与COX介导的炎症反应相关; (3) 导致肝星形细胞活化。
2 引起体内相关酶系变化 (1) 转氨酶上升。CCl4 引发肝实质损害时,天冬氨酸 转氨酶和丙氨酸转氨酶活力升高,且酶活力的高低 与肝细胞受损的程度相一致。 (2) 酶性抗氧化物改变。它们具有强烈的清除自由基 的作用,且互相依赖和支持,形成网络式的抗氧化酶 系统来拮抗CCl4 对肝脏造成的损伤。 (3) 细胞色素P450 酶系改变。CYP450 酶在CCl4 肝损伤发生过程中起到了十分重要的作用,以 CYP2E1 最为受到关注。
成模的标准
（1）血液：测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT) 、天 门冬氨酸氨基转移酶(AST) 、总胆红质(TB) 、总 蛋白(TP) 、白蛋白(A)血清等。 a.肝组织样品处理 血清:以3500 转/ 分离心 15～20min ,取上清夜低温保存,于一周内检测完. b. 肝样:取011g 加1mL 生理盐水匀浆,以3500 转 / 分离心15～20min ,取上清夜低温保存,于一周内 检测完. （2）组织病理学检查 取材：a.时间：分组给药后3h、6h、12h、24h。 b.固定：取肝脏将其固定于4 %（10%）甲 醛中, 经常规脱水, 石蜡包埋, 切5µm 厚切片, 常规 HE 染色、Masson 染色和Ret2culin 染色, 光镜下 观察 。
大鼠急性肝损伤的动物模型
前景
• 目前,肝损伤动物模型的复制主要有生物性、免疫 性、化学性等方法,生物学方法要求实验条件高且 费用昂贵,限制了应用。 • 免疫方法是造成免疫肝损伤,主要用于通过免疫机 制而抗肝损伤的药物研究。如：卡介苗(BCG) 加 脂多糖(LPS) 诱导法 、刀豆蛋白A 诱导法。 • 化学方法则是通过化学性肝毒物质,如四氯化碳、 氨基半乳糖、硫代乙酰胺、黄曲霉素等致肝损伤。 • 这里我们以四氯化碳性肝损伤 四氯化碳性肝损伤模型的建立来浅谈 四氯化碳性肝损伤 一下。
总结
目前选用鼠造模的较多,因鼠繁殖力强,生命力旺盛, 价格低廉;也有选用兔,因兔血容量大,肝脏大小适中,其肝 损伤易于生化及影像学观察。给药途径有多种,如皮下 注射、腹腔注射、灌胃、蒸气吸入或拌于食物中快速口 服等,优劣各家说法不一。灌胃法CCl4 经过门静脉系统 吸收,直接进入肝脏,模型制备理想,但操作复杂,肠道反应 , , , , 大;腹腔内注射门静脉浓度高,肝损伤形成时间短,但病死 率较高(20 %～35 %) ;皮下注射较腹腔注射具有如下缺 点,造模周期长,动物病死率高,相应增加了实验经费,因操 作不当可以发生皮下渗漏,但操作简便;蒸气吸入需快速 吸入,呼吸道刺激大,动物不耐受,中枢毒性大,易污染环境 和伤害实验人员;溶于少许食物快速口服,少吃多餐,挥发 减少,浓度低胃肠刺激减小,但受动物食欲影响,剂量难以 掌对肝脏的毒性机理，成功建 立其急性肝损伤模型。 2.熟悉建模过程中的各个环节，并能解决相 关问题，真正感受造模的过程，为将来真 正进入实验做铺垫。
四氯化碳性肝损伤的机制
关于CCl4 肝毒的作用机制,存在多种假设,但都一致公认,其主要 机制是自由基的形成及引发的链式过氧化反应。CCl4在体内可经 肝微粒体细胞色素P450 代谢激活,生成两个活性自由基(CCl3O2 和Cl) 及一系列氧活性物,可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质 发生过氧化反应,膜磷脂大量降解,从而破坏细胞膜结构完整性,引 起膜通透性增加,最终导致肝细胞死亡。另外,CCl4 的代谢产物能 迅速与细胞成分如胞内脂质、蛋白、核脂质、核蛋白和DNA 等 多种大分子发生不可逆的共价结合而导致细胞死亡,特别是当自 由基作用于DNA 时,损伤核糖和碱基,使核酸直接破坏引起DNA 链的断裂或DNA 链与蛋白间交联,影响其信息传递功能以及转录 和复制特性。在CCl4代谢产物引起的脂质过氧化物和共价结合的 双重作用下,导致膜脂质流动性降低、钙泵抑制、谷胱甘肽活性 抑制、肝微粒和线粒体功能丧失、肝细胞内钙稳态失调及代谢紊 乱,引起肝细胞损伤加剧 。
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改变细胞因子活性 CCl4 引发机体产生 的脂质过氧化产物,如丙二醛和42羟基壬醛, 可引发转化生长因子2β1、TNF2α,白细胞 介素等细胞因子的高表达,后者在CCl4 诱导 的肝纤维化的过程中发挥着重要作用。
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引起细胞凋亡 CCl4引发机体产生的自 由基的代谢紊乱会引起脂质过氧化产物的 积累,进而促进肝细胞的直接死亡或者凋亡。 其中,羟基自由基是促使肝细胞凋亡的重要 体内物质。CCl4 引发肝细胞凋亡的机制复 杂,一般认为都是通过激活死亡受体实现的。 另外,CCl4 也可引起肝星形细胞的凋亡。 CCl4 可激活核因子2κB ,引起细胞凋亡。
四氯化碳性肝损伤的关键点
1.急性肝损伤是一个短期过程，一般在1248h内成模，因此，分组建模、取材、标本 固定的时间安排等很重要。 2.腹腔注射CCl4溶液，要注意进针部位、深 度。对给药浓度和剂量，因为鼠源不同或 相关文献数据的不一致性，可以分组进行 不同剂量、浓度的对比性实验。 3. 在制模过程中可以加入戊巴比妥或乙醇代 替饮水，以加速肝损伤进程。
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毒性基因组学变化 近年来,国内外很多学 者运用基因芯片技术对CCl4 的毒性机制进行 了探讨,初步形成了CCl4 的基因组学研究体系。 CCl4急性肝损伤实验表明,6 和24 h 是CCl4 的损伤阶段,而48 h 至2 周则是CCl4 后引发损 伤后的自我修复阶段；CCl4 慢性肝损伤试验 表明,30～60 d阶段作为脂肪变性期,60～90 d 为肝纤维化形成期。