的，最好得到另外的信息: (1)先得到任何一组分的稳态荧光光谱，然后调
节检测器相角至该荧光光谱和混合物的荧光 光谱重叠，则可得到与另一组分正交的相角。 (2)使用任何一组分的纯溶液以确定检测器的相 角。
精品课件
当用相灵敏检测器在各种不 同检测器相角测绘样品的相灵敏荧光 光谱。对于单一化合物，其荧光峰波 长基本上保持不变而与检测器相角无 关。如果不是均匀的发射，则荧光峰 随着检测器相角而改变，在不同检测 器相角得到的相灵敏光谱是鉴别不均 匀发射的有力工具。
激发光源、时间延迟设备、激发单色器、 样品池、荧光单色器及设有门控的检测器
1、激发光源 短脉冲的激发光源
闪光灯
氮闪光灯 线 氢闪光灯
氘闪光灯
几条高强度射 连续线 强度低
精品课件
氮分子激光器
337.1 nm
激光器 氩离子激光器
351 nm
染料激光器 波长
所需
光子通量大、峰值功率高、单色性好、发 生的光脉冲持续时间短，激光荧光法具有 较高的灵敏度和选择性。
精品课件
（2）定量依据
I S (e,x e) m K E C X (e) E x b M (e) m （1）
E X 激发光谱强度分布
E M 发射光谱强度分布
emex
ISKC EX b(em )EM(em ) ISKC EX b(ex )EM(ex)
（2） （3）
（2）同步扫描激发波长时的发射光谱
相灵敏荧光光谱，即为在固定时间的 荧光光谱。
精品课件
若样品溶液中含有 A、B 两种荧光体， 它们的荧光寿命分别为A和B。
F (, t ) F A () m A st i n A ) F B m ( B st i B n ) (
F ( ,D ) F A ( ) m A cD o A ) s F B ( ) ( m B cD o B )s(
在松弛过程中，能量有所降低，因而发 射向长波位移。
时间分辨荧光法可记录不同时间的发射 光谱，因而可测量松弛时间。
精品课件
例1 4-氨基苯邻二酰亚胺（4-AP）的丙醇溶 液
在不同的温度下的时间分辨的荧光
光谱室图温下， -132℃ 荧光光谱与时间t无关
在-77K，荧光光谱与t 有关
在 4ns， 溶剂还未重新取向 在23ns， 溶剂取向已完成
m 越小 发射光被调制的幅度越小
随 的增大而增大，寿命越长，延迟的 越大。
当荧光分子的寿命越长，发射相对于激发延迟 的时间就越长。
精品课件
2、多指数衰变的荧光
如果样品中含有两种荧光体，或者单一 荧光体而进行进一步激发态反应，则荧光是双 指数衰变。如果进行多步反应，则荧光是多指 数衰变。
由 和 m 所计算的 是表观荧光寿命。
如采用相灵敏检测器的相荧光计，
单一荧光体
F (t) 1 m L m si tn ) (
m L — 激发光的调制度（或振幅） m — 去调制因素
精品课件
对于相灵敏检测器
F (,D ) k( F )co D s )(
F ( ) — 稳态荧光光谱 D — 检测角度
在不同相角 D 测定荧光光谱，称为
NOR. EM. SCAN
精品课件
em /nm
1、固定波长的同步荧光光谱 (Constant wavelength synchronous luminescence , CWSL)
(1) 在同步扫描中，使激发波长与发射波长保
持固定的波长间距，即emex
常数。将同步荧光信号对发射或激发波长测绘荧 光光谱图，则为固定波长的同步荧光光谱。
对于以光栅为单色器的荧光分光光度计， 只要分别设置激发和发射两个单色器所需的起 始波长，并使它们以同样的速率进行扫描，便 可进行固定波长同步扫描荧光测定。
2、固定能量同步扫描 是非线性的可变角同步扫描，需通过微
处理机控制而加以实现。
精品课件
三、应用
1、在多环芳烃分析中的应用 减小光谱的重叠
（1）固定波长同步荧光法用于煤中多环芳烃 的测定
如 i D 90，则该组分的发射被抑制
DA90 F (,A 9 ) 0 F B () m B siB n A )( DB90 F (,B 9 ) 0 F A () m A siB n A )(
精品课件
要得到混合物中组分A的稳态光谱，须把 检测器相角调节至和组分B正交。这是很费时
相分辨法的优点 a. 仪器类似于稳态测量的仪器，使用简单； b. 灵敏度高； c. 数据处理快。
精品课件
（2）测量参数
a. F(t)-t 曲线
时间分辨
b. m. .
相分辨
精品课件
（3）从实验的观点，相分辨有下列优点： ➢ 在时间分辨的方法中，测量的延迟信号的去 卷积对于计算测量系统的限定时间的响应是必要的， 而相分辨法不受此限制； ➢ 相分辨法允许不同方向的直接测量。如在各
dN(t)(k)N(t)
dt
N(t)
dN(t)(k)
t
dt
N0 N(t)
0
受激分子的寿命 (k)1
t
N(t) N0e
F(t)N0et F0et
精品课件
用 F(t) 或 N(t) 对 t 作
图
F(t) or N(t)
1/e
lg F ( t )
or
lg N ( t )
t
t
lgF(t)lgF0(tlge)
精品课件
2、固定能量的同步荧光光谱 constant energy synchronous luminescence (CESL)
Ray
Roman
固定能量的同步荧光光谱，是指在同步扫描 过程中，使激发波长与发射波长之间保持着 固定的能量差。
精品课件
( 1 1 )107 常数 ex em
表示波数差 c
（2）二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽 5nm
精品课件
（3）酪氨酸和色氨酸严重重叠
CWSL
60nm的同步荧光 15nm的征同步荧光
征
色氨酸的光谱特 酪氨酸的光谱特
30nmor 70nm 的二阶导数同步荧光可
对
Trp 和 Tyr 分
50nm辨同步荧光可对Trp、Tyr、Phe分辨
精品课件
（4）维生素B1、B2混合物中维生素B1的测定 用铁氰化钾将B1氧化硫胺荧
与 成正比
拉曼光与入射光之间的频率差称为拉曼位移 R
R RayRom
精品课件
当 R 或 R 时
固定能量的同步荧光光谱可消除瑞利散射 和拉曼散射，而固定波长的同步荧光光谱只能消除 瑞利散射，使拉曼散射拉宽。二者皆能降低光谱的 复杂性，提高选择性。
F a
b
c
精品课件
二、同步扫描仪器设备 1、固定波长的荧光光谱的获得
精品课件
2、检测器 如光电倍增管 带有门控的
精品课件
三、时间分辨荧光的分析应用
荧光体的荧光寿命的测定 时间分辨荧光光谱 荧光发射的衰变曲线
精品课件
1、荧光体混合物中两组分的同时测定
例 用8-羟基喹啉-5-磺酸(R)同时测定Al 和Ga
15.20 ml 样品 + 1 ml 0.045% R +
2 ml 20% NH4Ac (or 20% NH4Cl ) 调 pH 至4.5，稀释至25 ml
（3）同步扫描发射波长时的激发光谱
精品课件
（3）同步荧光光谱的特点
a. 同步光谱与激发光谱及发射光谱都有关系。 它同时利用了化合物的吸收特性和发射特性， 因而使光谱分析的选择性得到改善。
b. 有利于多组分混合物的分析。同步荧光光 谱可以把强带增强而减小弱带的干扰。
c. 可消除 Raylei 干扰，使 Roman 强度降低 且拉宽。
氘灯激发
测定荧光强度—时间曲
线
精品课件
（1）测定荧光衰变曲线
Al – R Ga – R
10.8ns 4.3ns
6.5ns
可利用上述两个荧光化合物的差异 对它们进行同时测定。
精品课件
（2）计算含量
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
铝配合物和镓配合物的 衰变曲线
铝配合物和镓配合物的 对数衰变曲线
比较（1）和（4）的荧光强度得Al的含量
比较（2）和（5）的荧光强度得Ga的含量
精品课件
2、芳基的测定 例 用ps双色荧光法对卤素芳族化合物光离解
作用所产生的芳基进行检测
（1）用25ps，266nm 激光脉冲使1-(氯甲基)萘，
1-(溴甲基)萘， 2-(氯甲基)萘， 2-(溴甲 基)萘等化合物离解产生芳基。
（2）在延迟60ps后，用25ps，355nm激光脉冲激 发芳基的荧光，产生橙色荧光，600nm， 10ns，如图所示。
苊(Ace )，2,3-苯并芴(BF)，蒽 (Ant)，
苯并芘(Bap)， 苝(Per) 用标准加入法计算2,3-苯并芴
（2）低温固定能量同步荧光法
精品课件
煤液化样品中各种有机物 的同步荧光光谱
煤液化样品的固定波长同步 荧光光谱
精品课件
2、同步荧光法在医药检验方面的应用 （1）违禁药品中苯丙胺和吗啡加奎宁麦角酸 二乙酰胺的测定
精品课件
The objective of both timedomain and frequency-domain fluorometry is to recover the parameter describing the timeresolved decay.
精品课件
一、相分辨法原理 1、单指数衰变的荧光 当样品被激发光激发而发射荧光时，如
激发光的光强度被正弦调制，其角调制频率为， 则发射光也同样被调制。由于吸收和发射之间的 时间延迟，调制的发射光比起激发光在相上延迟 了角。但发射光的调制比起激发光的调制小一些， 也即是发射光的改变部分的相对幅度比起激发光 要小些。