衰退现象（续）
• • • • （3）继代培养次数： 影响因培养材料而异。 有些植物长期继代培养仍保持再生能力和繁殖力。 有些植物继代增加，变异频率增加，如香蕉不定芽， 继代5次为2.14%；10次为4.2%；20次为100%变异。 故香蕉继代培养不能超过一年。蝴蝶兰连续培养4年后， 植株退化不开花。 • （4）季节：有些植物材料能否继代培养与季节有关。 如水仙鳞茎，六七月份休眠，生长变慢，8月休眠后， 生长加快。 • 百合鳞片分化能力：春季>秋>季夏季>冬季
• 1952，Morel（法）和martin，首先利用茎 尖分生组织脱毒了无病毒苗，建立茎尖脱 毒组培体系
2、茎尖脱毒的原理
• 基本原理：利用病毒在植物组织中分布的不 均匀性（分生组织无病毒）
• 而茎尖培养脱毒的可能原因（1-5）： • 1，旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高， 使病毒无法进行复制
清具有高度的专化性，因而可用于鉴定受感染而没有 症状的带毒植物。
试管沉淀反应；免 疫双扩散；酶联免疫吸附测定
(ELISA)。
• 衰退现象发生的影响因素： • （1）植物材料：不同植物，不同品种，不同器官 或不同部位的继代繁殖能力都不相同。 • 通常：草本植物>木本植物，被子植物>裸子植物， 年幼材料> 老年材料；胚> 营养组织，胚> 胚状体 > 愈伤组织 • （2）培养基和培养条件：培养基和培养条件适当 与否对继代培养影响颇大,所以常用改变培养基和 培养条件来保持继代培养。 • 石斛兰茎尖或掖芽培养，固体培养基培养形成原 球茎后，继代培养要用液体培养基进行振荡培养。
菊花 康乃馨 水仙 唐菖蒲 风信子 月季 天竺葵
19 11 4 5 3 10 5
矮牵牛 马铃薯 大蒜 豌豆 百合 柑橘 苹果
5 17 24 15 6 23 36
葡萄 樱桃 无花果 桃 梨 草莓
26 44 5 23 11 24
1.4 有关病毒病的研究历史
• 1934,white（美） 观察烟草根系， • 发现：病毒在根，茎的分布不均匀。离根 尖和茎尖越近，病毒的密度越低，反之， 越高。 • 分生组织一般无病毒，病毒在生长旺盛的 部位繁殖速度慢.
• 目前受病毒危害严重影响生产的有： – 大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草。 – 蔬 菜：白菜、大蒜、葱、番茄、黄瓜、 辣椒。 – 果 树：柑橘、苹果、草莓、香蕉。 – 花 卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、 紫罗兰等
• 危害园艺植物的病毒数目
植物种类 染病毒种 类 植物种类 染病毒种 类 植物种类 染病毒种 类
1.病毒病及其危害
• 脱毒（virus elimination)培养： • 利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中的 病毒，生产健康的无毒繁殖材料的过程。
1.2.植物病毒病及其危害
• 定义：由植物病毒寄生引起的病害。 • 症状：
–①变色，叶片的叶绿素形成受阻或积聚，从而产 生花叶、斑点、环斑、脉带和黄化等。花朵的花 青素也可因而改变,使花色变成绿色或杂色等,常 见的症状为深绿与浅绿相间的花叶症如烟草花叶 病。 –②坏死，在叶片上常呈现坏死斑、坏死环和脉坏 死，在茎、果实和根的表面常出现坏死条等。 –③畸形，器官变形，如茎间缩短，植株矮化，生 长点异常分化形成丛枝或丛簇，叶片的局部细胞 变形出现疱斑、卷曲、蕨叶及带化等。
常用的指示植物有:千日红(Gomphrena globosa);苋色藜(Chenopodium amaranticolor)和各种烟草.
由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选 择适合的指示植物。
四、脱毒植物的鉴定方法（续）
血清鉴定(serological test)(抗原抗体反应)：病毒抗血
1.病毒病的危害及症状
正常的番茄果
番茄厥叶，卷叶病毒
番茄病毒病（植株）
香蕉束顶病
俗称虾蕉、葱蕉或蕉公)，病株一般 不抽花蕾，因近顶部叶片成束而得 名。是由病毒侵染植株而引起的, 是 香蕉致命病害, 蕉农称之为" 不治之症"。局部地区 蕉园发病率为2%～10%, 产量损失 30%～60%。
1.病毒病及其危害（续）
• 脱毒时，最好找出茎
原基所带叶原基的数 目与生长点（茎尖）
大小的相关性，这样剥离技术 要求越高，成功率越 低
表2 离体茎尖长度对马铃薯脱毒的影响 • 茎尖长度
/cm
叶原基数
0.12 0.27 0.60
1 2 4
发育成小植株 无病毒 数 再生植 株 50 24 42 18 64 0
表3.带病毒植株脱除病毒时宜采用的茎尖大小
植物种类
病毒种类
茎尖长度 /mm
1.0-3.0 0.2-0.5 1.0-3.0 0.2-0.3 <0.2 1.0-2.0 1.0-2.0 0.3-1.0
品种数
马铃薯
马铃薯Y病毒 马铃薯X病毒 马铃薯卷叶病毒 马铃薯G病毒 马铃薯S病毒
1 7 3 1 5 6 1 2
四、脱毒植物的鉴定方法（续）
指示植物 (test plants)鉴定——利用病毒在其他植物 上出现症状的特征，作为鉴别种类的标准。这种专用 以产生症状的（寄主）植物就是指示植物。寄主植物
能够辨别某种病毒的专化性症状。
方法：将待测植物的汁液接种到指示植物，如果待测 植株带毒，则指示植物上会出现特定症状。
酶缺乏，1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成 需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒 无法在分生组织中复制。
抑制因子，1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子 假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子
3.茎尖培养脱毒的过程
• 一，脱毒前的准备工作： • 1.被脱毒植物携带病毒的诊断 • 根据植物病毒病的症状特征和表现程度判断病 毒类型及感染程度。 • 2.母体植株的选择和预处理 • 母体的选择：欲脱毒材料的品种典型性；外植 体健康程度选择;无损伤。
2。传导抑制： （1）病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的 ，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病 毒向分生组织的传导。（2）通过胞间联丝（但茎尖无胞 间联丝）。
3. 激素抑制，在分生组织中，生长素和细胞分裂素水 平均很高，可以抑制病毒增殖，因而阻滞了病毒的侵入 或者抑制病毒的合成。
2.外植体（毛地黄叶片）--愈伤组织—再生植株
愈伤组织
愈伤组织再生的不定芽
5.外植体（叶片等）--原球茎---再生植株（兰科植物）
大花蕙兰原球茎增殖与植株再生
6.外植体（叶片）-（或愈伤）-体胚---再生植株
体细胞胚胎发生
8.外植体—孢子—小植株（蕨类植物）
二，培养方式
固体培养：
液体培养
温室移 栽炼苗
一，植物快速繁殖的途径和方法
类型
器官型 器官发生型 胚状体发生型
方式
直接以芽增殖 脱分化,愈伤再分化
从愈伤或外植体直接 产生
特点
繁殖系数高,遗传性 稳定 繁殖系数高低,用于 细胞分化研究 繁殖系数高,
事例
甘蔗,香蕉,香石竹等 烟草,油菜等 胡萝卜,石刁柏等
原球茎型
球茎芽型
外植体产生原球茎
叶柄-圆球形小突起球 茎芽
5. 脱毒效果检测 一般来说，再生植株后，在18个月以内进行病毒 鉴定，因为病毒在植物体内的潜伏期为6-12个月以 上。
茎尖脱毒培养注意事项（要考）:
• 1，茎尖越小,带有病毒的可能性就越小,但 太小又不易成活. 2，茎尖培养的成活率与所取的茎尖大小成 正比；茎尖培养的脱毒效果与所取的茎尖 大小成反比. • 3.培养基中尽量不用2,4-D(变异) • 4.茎尖培养还可除去其它病原体,如细菌,真 菌等.
甘薯 甘蔗 大丽花
斑叶花叶病毒 缩叶花叶病毒 羽毛状花叶病毒
花叶病毒 花叶病毒
0.7-0.8 0.6-1.0
1 1
3.茎尖培养脱毒的过程（续）
• • • • 3.茎尖培养: MS 培养基; 怀特培养基等（高盐培养基）, .添加5-1-%椰乳;0.1-1.0 毫克/升IAA,NAA 或 者说-BA,活性碳等. • 4.提高脱毒效果的方法:高温处理,低温处理, 化学处理(加入嘧定,或嫖呤的类似物,氨基酸, 抗生素处理,三氮唑核苷) • 5.脱毒苗的鉴定:
4.脱毒苗的鉴定和保存
• 并非所获得的无菌苗均为无毒苗,如生长点培养的 无毒苗成苗率和脱毒率都非常低,所获品种在用作 无毒苗原种之前均需进行病毒鉴定,方法如下: • (1).直接测定法 • (2)指示植物法: • 3. ELISA • 4.分子生物学方法等。
4、脱毒植物的鉴定和保存
指示植物鉴定
抗血清反应鉴定 直观鉴定 ISEM
• （1）症状:花而不实 • 花叶型马铃薯病毒：退化，叶片卷缩，产量逐年下降，
到PVS，PVA，PVM，PVX
• 卷叶型马铃薯病毒：PLRV • 香蕉束顶病：叶片越来越短小，植株矮缩，叶硬 直成束（毁灭性病害）.不结果或果特心,异常 • 柑桔黄龙病:苹果花叶病毒，番茄病毒病，葱类黄 矮病，菊花斑萎病，兰花叶病，白合丛生病。
继代培养
• 蝴蝶兰，蕙兰等也如此。 • 驯化发生的原因：可能是继代培养中细胞 积累了较多的生长物质，因此逐渐减少对 外源生长物质的需要。 • 驯化的不足：长期继代，卡德利亚兰只长 芽不长根，芽多而细弱。
3 衰退现象：长期继代培养的组培材料也会逐渐衰退
（recession），丧失形态发生能力（生长不良，再生能力和增殖 力下降等）
第2节 植物快速繁殖的应用
• 1.大量繁殖珍稀或名 贵植物 • 如:佛肚兰,卡特丽亚 兰等工厂化育苗 • 2.茎尖培养脱毒及脱 毒苗的培养 • 无菌苗 • 有毒苗 • 脱毒苗
二，（茎尖培养）脱毒及其应用
• 1.病毒病及其危害 • 2.茎尖培养脱毒的原理 • 3.茎尖培养脱毒的过程 • 4.脱毒苗的鉴定和保存