胚胎干细胞发育分化的表观遗传学调控机制研究概述摘要：ESC多能性的维持与分化系统提供了一个描述哺乳动物发育进程的理想模型，胚胎干细胞具有非常重要的理论研究意义和临床应用前景。
以胚胎干细胞为模型，研究有关干细胞分化的表观遗传调控已成为新的研究热点。
在广泛文献调研的基础上，本文重点介绍DNA甲基化和组蛋白修饰这两个热点研究领域的前沿进展，从而探讨ESC细胞多能性的维持与分化的分子机理，为进一步研究提供参考资料。
关键词：ESC；发育分化；表观遗传学；DNA甲基化；组蛋白修饰Study on epigenetic regulation in differentiation of embryonic stem cells Abstact:Progression from stem cells into different differentiated progeny requires long-lastingchanges in gene expression. Emerging evidences suggest that embryonic stem /progenitor cells are excellent candidates for exploring stem cells differentiation mechanism involving the action of a unique epigenetic program.The review focuses on dynamic epigenetic regulation of DNA methylation, histone modification in embryonic stem cell differentiation and also highlights a general role of epigenetic changes in stem cell differentiation.Key words: embryonic stem cell,development and differentiation; epigenetic;DNA methylation, histone modification胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)是从早期囊胚的内细胞团(inner cell mass, ICM)分离出来的一种多能细胞系；它能在体外长期不断自我更新，并保持多向分化潜能，可以分化为内、中、外3个胚层的几乎所有类型细，其种系传递特性一直是遗传学、胚胎学、细胞生物学和发育生物学非常关注的研究对象之一［1］。
ESC位于个体发育的顶端，在正常的发育过程中其多样性是暂时的，随着胚胎发育的进行，其多能性逐渐丧失而分化成各种类型的胚胎组织。
因此ESC 多能性的维持与分化系统提供了一个描述哺乳动物发育进程的理想模型［2,8］。
表观遗传学是研究在基因型不发生改变的情况下产生可遗传基因表达改变的学科。
这种改变是细胞内遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递［5］。
随着表观遗传学的飞速发展，人们已经认识到表观遗传调控在发育分化中起着重要的作用［4］（图1）。
例如组蛋白赖氨酸甲基化与脱甲基化介导的基因转录调控是发育分化过程中表观遗传调节的重要部分。
ESC发育分化过程中的表观遗传学修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰、印记基因、染色体失活及RNA干扰等［7］。
其中DNA甲基化和组蛋白修饰使表观基因组调控ESC多能性与发育分化的两种重要机制［2］，是近年来研究的重点和热点。
因此，在广泛文献调研的基础上，本文试图从表观遗传学的角度，重点介绍DNA甲基化和组蛋白修饰这两个热点研究领域的前沿进展，从而探讨ESC细胞多能性的维持与分化的分子机理，为进一步研究提供参考资料。
1.DNA甲基化在哺乳动物中,DNA甲基化通常发生在双核苷酸CpG中的胞嘧啶上,形成甲基化的CpG（图3A）［3］，它们在基因组中有特定的表达谱式。
在个体发育的特定阶段及细胞分化时，DNA甲基化基因表达谱会发生变化，例如在胚胎发育的早期，DNA甲基化修饰被去除，多能性基因的到表达，而发育相关基因受到甲基化抑制。
从而在基因表达调控，基因印记及染色体失活等重要的生理过程中发挥重要作用，导致细胞多能性的改变及分化［1］。
1.1DNA甲基化形成机制CpG二核苷酸胞嘧啶的甲基化过程是在DNA甲基化转移酶（Dnmt）催化下,一个甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到胞嘧啶环的第5位碳原子上。
DNA甲基化转移酶主要包括所含有的氨基酸数分别为1616,391,912,853和387的Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dn-mt3b和Dnmt3L。
Dnmt1蛋白在G1、G2期定位于核质,S 期复制,具有较强的体外催化活性,其mRNA主要表达于胎盘、脑、肺、心脏等组织；Dnmt2蛋白亚细胞定位无特异性，体外无催化活性，其mRNA在各个组织中均有低水平的表达；Dnmt3a的mRNA主要在胚胎干细胞中大量表达,成体和胚胎有低水平表达,具有周期依赖性,其蛋白在细胞分裂过程中周期性地定位于细胞核,复制主要在S期,体外催化活性较弱；Dnmt3b的mRNA主要表达于未分化的ES细胞、胚胎、睾丸,具有细胞周期依赖性,其蛋白在NIH3T3细胞中分布于核内,在胚胎干细胞定位于异染色质中,体外未检测到明显的催化活性；Dnmt3L的mRNA主要表达于睾丸和胚胎中,其蛋白的亚细胞定位无特异性,体外催化活性较弱。
在5种DNA甲基化转移酶中,Dnmt1具有维持甲基化的作用,Dnmt3a和Dnmt3b有催化重新甲基化的功能。
DNA甲基化转移酶的催化过程需要辅助蛋白Dnmt3L［3-10,14］。
1.2DNA甲基化在胚胎干细胞分化中的作用Shen等研究表明，在胚胎干细胞向神经干、祖细胞分化的过程中，大约有1.4%的CpG岛发生了显著的重新甲基化过程。
此外还发现，胚胎干细胞的重新甲基化过程与癌细胞显著不同，两者的CpG岛基因没有任何重叠。
在人类胚胎干细胞的长期培养过程中，虽然印记基因座的甲基化模式是相对稳定的，然而在一些胚胎干细胞系中，一些特定肿瘤的抑制基因的甲基化增强子是增多的。
此外，在人胚胎干细胞的分化过程中，重新DNA甲基化转移酶参与了CpG岛的甲基化，动态的DNA甲基化通常发生在细胞非CpG岛区域的种系分化基因中。
此外，甲基化印记基因Dnmt1或者Dnmt3的缺陷将导致小鼠基因组大规模的DNA低甲基化和早期胚胎的致死。
这就提示，对于正常的机体发育，DNA甲基化转移酶介导的表遗传程序是不可或缺的。
然而，在早期胚胎发育时期，Dnmt3a和Dnmt3b 如何参与建立体细胞系分化过程中的表观遗传标记仍需进一步探索［2-4,10-11］。
2.组蛋白修饰组蛋白是真核生物染色体的结构蛋白,是构成核小体的基本单位。
组蛋白是一类小分子碱性蛋白质,分为H1、H2A、H2B、H3及H45种类型,它们富含带正电荷的碱性氨基酸,能够与DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用，发生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化、ADP-核糖基化等共价修饰作用（图3B），而且这些修饰几乎都可以逆转。
染色质上的修饰可有专门的结合蛋白识别，解读其功能，导致转录活性的开或关两种状态，决定基因的活性。
在ESC中，结合在染色质上的蛋白相对于体细胞都比较松散，以利于一旦ESC细胞需要分化时可使转录因子更加容易结合上去建立新的分化细胞特异性的基因程序。
即正是其中较松散和开放的染色质结构才使ESC具有了建立各种体细胞特异性基因程序的能力，使其具有多能性［1-4,15］。
2.1组蛋白的甲基化修饰组蛋白甲基化修饰可以发生在赖氨酸或精氨酸残基上，组蛋白赖氨酸甲基化发生在组蛋白H3的N端4、9、14、27、36及79位，组蛋白H4的N端20及59位赖氮酸，每个位点又分单、双和三甲荃化。
通常H3的4、36、79位赖氨酸甲基化与常染色质及转录激活有关，H3的9、27位以及H4的20位赖氮酸甲基化与异染色质及转录抑制有关。
目前已发现多种具有组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性的蛋白质分子，有的晶体结构已解析，组蛋白赖氨酸甲基转移酶〔除Dotl外)均含有一个SET[su(var)，enhance of zeste，trithorax]结构域、负责催化和结合供体甲基AdoMet。
组蛋白甲基化修饰并不影响氨基酸的电荷数，但会造成空间位阻并导致疏水性变化，破坏分子内或分子氢键，形成新的蛋白质结合位点［9-11,］。
由美国麻省Whitehead生物医药研究院的Rudolf和Richard Yong两个实验室最近的研究表明，干细胞之所以据有全能性主要是因为聚梳蛋白（Polycomb group，PcG)抑制了启动体细胞分化调控蛋白的转录。
他们在小鼠和人类ESC中鉴定出几百多个聚梳蛋白抑制的基因，而这些基因大部分也受到干细胞所特有的转录因子Oct4、Sox2、Nanog的抑制，因而另一侧面证明了PcG蛋白家族与Oct4、Sox2、Nanog之间的相互作用是维持ESC全能性的关键。
这些PcG靶基因在干细胞分化时才表达，如果在干细胞中不受抑制，他们就会发生分化。
在此之前的研究证明，PcG蛋白家族与组蛋白H3K27甲基化有关，有了这种共价修饰，染色质与各种转录因子之间的结合能力降低，使转录过程受到抑制［1-3,12］。
由Eric Lander带领的麻省理工与哈佛大学的研究组发现，干细胞染色质的某些地方具有―二价区域‖的特性，这些二价区域既含有一直转录的H3K27甲基化标志［2,3］（图2，图3A）。
这些区域的DNA序列属于哺乳动物进化中比较保守的非编码调节序列，位于发育相关转录因子编码区的上游。
在干细胞分化时，其中一种修饰被去掉，只剩下H3K27甲基化或H3K4甲基化。
分化时不表达的基因一般只留下H3K27甲基化，而被激活的基因一般保留H3K4甲基化。
这些二价染色质区域对于干细胞来说具有重要意义，一方面，它们可以抑制参与体细胞激活途径的转录因子的表达，另一方面在干细胞开始分化的时候又可以很快改变。
每个细胞的命运再决定之前，其主要调节基因必须处于沉默状态。
但随着时间的推移，细胞命运一但需要决定，这个细胞又必须时刻准备激活其中一种调节基因，启动细胞分化。
二价染色质区域的表观遗传修饰使这些基因在细胞未分化时就做好了准备。
因此，在一定程度上可以说干细胞分化是特定的表观基因组建立的过程［3］。
（图4）。
2.2组蛋白的乙酰化修饰组蛋白乙酰化与基因活化以及DNA复制相关,组蛋白的去乙酰化与基因的失活相关。
Hajkova等研究显示,组蛋白的乙酰化修饰大多在组蛋白H3的Lys9,14,18,23和H4的Lys 5,8,12,16等位点,该过程是一可逆的动态过程,由组蛋白乙酰化酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶( HDACs)调控。