http://www.paper.edu.cn - 1 - D609诱导小鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化1
赵洪令，孙春辉，陈箐，赵静，张尚立，苗俊英 山东大学生命科学学院发育研究所，济南（250100） E-mail: miaojy@sdu.edu.cn 摘 要：研究D609能否诱导小鼠骨髓间充质干细胞定向分化为神经元样细胞。参考Pittenger的方法提取小鼠骨髓间充质干细胞；倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经纤维丝蛋白（NF）的表达；利用荧光探针（DCHF）并结合激光扫描共聚焦显微术检测分化细胞内活性氧(ROS)水平。结果表明D609能诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞，并表达神经元特异性蛋白NSE、NF。分化过程中ROS水平升高，FGF-2能通过降低细胞内的ROS水平提高细胞存活率。 关键词：D609；骨髓间充质干细胞；神经元分化
1. 前言 骨髓间充质干细胞具有很强的自我增殖能力和分化潜能，能在特定的体内外环境条件下分化为神经细胞[1]。磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C（PC-PLC）是多种细胞中普遍存在的一种磷脂酶，其结构、功能、亚细胞分布具有物种、细胞特异性。本课题组在研究中已经发现PC-PLC参与调节血管内皮细胞、肺癌细胞以及神经元的增殖、分化和凋亡等多种信号通路[2]。同时发现PC-PLC的特异性抑制剂D609[3]能诱导部分人脐带静脉血管内皮细胞和大鼠骨髓间充质干细胞（rat Bone Mesenchymal Stem Cells，rBMSCs）定向分化成神经元样细胞[4]。小鼠骨髓间充质干细胞（mouse Bone Mesenchymal Stem Cells ,mBMSCs）是一种重要的动物实验模式细胞，D609能否诱导小鼠mBMSCs分化成神经元样细胞？目前尚未搞清。 研究表明，非毒性水平的ROS能作为信号分子，参与细胞增殖、分化和凋亡的信号转导，从而调控这些重要细胞活动[5]。我们先前的实验结果表明,ROS参与rBMSCs向神经元分化的过程。另外，碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）能维持分化的细胞存活[6]。为了探讨D609诱导mBMSCs向神经元分化的分子机制，我们检测了mBMSCs分化前后ROS水平的变化以及FGF-2对ROS水平的影响。
2. 材料与方法 2.1 材料 昆明小鼠（山东大学实验动物中心）；DMEM（low glucose）培养液（美国GIBCOBRL公司）；胰酶（上海生工）；D609 (Cat. No. T-8543；美国Sigma公司)；NSE及NF抗体 （美国Sigma公司）；MTT（美国Amresco公司）
2.2 方法 2.2.1 mBMSC的提取、培养 选用6～8周龄健康雄性昆明小鼠，乙醚麻醉后淹死，无菌条件下分离股骨和胫骨，用注射器吸取4mL MSC培养液冲出骨髓，吹打成单细胞悬液，种于直径60mm的塑料培养皿
1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20050422013）的资助。 http://www.paper.edu.cn - 2 - 中。置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，3天后换液，以后隔3~4天换一次培养液。用流式细胞分光光仪检测细胞纯度。
2.2.2 D609诱导mBMSC分化 实验分正常组、对照组、实验组三组。将含有2×104个细胞/mL培养液种于24孔板中。
24h后，加入D609诱导分化：对实验组两种处理，即分别加入只含D609(4, 8 µg/mL)的DMEM储存液和同时含D609(4, 8 µg/mL)与FGF-2 (4µl/ml) 的DMEM储存液。
2.2.3 免疫细胞化学检测 弃旧培养液，用0.1 M PBS缓冲液冲洗，4%多聚甲醛固定后，0.1M PBS清洗，用血清封闭液封闭10-20min后，弃封闭液，加入一抗（兔多克隆抗NSE、NF抗体），4℃过夜；用0.1M PBS清洗，加入二抗（羊抗兔IgG-FITC）。37℃反应30min后，用0.1M PBS冲洗，用激光扫描共聚焦显微镜观察、分析结果。
2.2.4 ROS水平测定 弃24孔板中培养液，用无酚红DMEM培养液轻轻冲洗细胞两次后，加入含有DCHF应用液，37℃孵育30min；用无酚红DMEM培养液轻轻冲洗细胞两次；激光扫描共聚焦显微镜下观察，用软件随机选取视野分析荧光亮度。
2.2.5 数据分析 将多次测得的分化率数据和ROS水平数据用平均数±SE表示，用t-Test计算P值，当P值小于0.05时，视为差异显著; 当P值小于0.01时，视为差异极其显著。
3. 结果 3.1 mBMSC的培养及形态观察 小鼠单个核细胞培养3d后，在镜下可见散在的贴壁细胞，呈梭形或三角形，并有小集落形成（图1a）。第8、9d，细胞集落逐渐与邻近集落融合，交错成片（图1b）。传代后细胞呈细长梭形，经3次以上传代后，细胞成分均一，纯度在95%以上。
图 1骨髓间充质干细胞的形态学观察 (a)培养3天的mBMSCs (b)培养8天的mBMSCs http://www.paper.edu.cn - 3 - 3.2 分化后神经元的鉴定 (1) 在倒置相差显微镜下观察，发现用D609处理的mBMSC细胞胞体变圆、透亮、有很多突触产生，出现简单的双极细胞和复杂的多极细胞，表现出神经元样的细胞形态。随着D609浓度的增加，分化的细胞比例也增加(图2A)。在加入4µl/ml的FGF-2后，分化细胞数目都增多，说明FGF-2的存在能提高细胞存活率(图2B）
图 2 D609对mBMSC形态的影响（6h） A. 无血清，去除FGF-2 后，不同浓度的D609对mBMSC的影响 (a) 对照；(b) 2µg/ml D609; (c)4µg/ml D609; (d)8µg/ml D609 B. 无血清, 添加FGF-2 (4µl/ml)，D609诱导mBMSC分化为神经元样细胞 (a)对照; (b)2µg/ml D609 ; (c)4µg/ml D609; (d)8µg/ml D609
(2) D609诱导6h后，免疫细胞化学检测发现细胞呈现神经元特异性标记NSE和NF表达阳性，而在对照组细胞中，NF、NSE呈现微弱表达或不表达（图3 A,B），并且其表达随着D609浓度的增加有明显的增强趋势。
图 3 A，去除FGF-2和血清,分化的mBMSC表达神经元特异性标记蛋白NF（6h） (a) 正常组 (b) 对照组 (c) 4µg/ml D609 (d) 8µg/ml D609 B，去除FGF-2和血清,分化的mBMSC表达神经元特异性标记蛋白NSE（6h） (a) 正常组 (b) 对照组 (c) 4µg/ml D609 (d) 8µg/ml D609 http://www.paper.edu.cn - 4 - 3.3 ROS水平的测定 细胞中ROS水平检测结果显示，分化细胞中ROS水平显著升高（图4）。在同时加入D609和FGF-2的细胞中，ROS水平比对照组高，但是与D609单独处理组低。
图 4 mBMSC细胞分化过程中ROS水平的变化 (6h) A 荧光照片(a, 对照组; b， 4µg/ml D609; c， 4µl/ml FGF-2加4µg/ml D609） B 荧光量化图，显示细胞内ROS的水平 ((*) P<0.05, (**) P<0.01)
4.讨论 PC-PLC在信号传递过程中具有重要作用，参与调控细胞增殖、分化和凋亡。在白血病细胞中，PC-PLC参与红细胞的分化过程[7]。在巨噬细胞中，分化信号依赖于PKC和PC-PLC的活化[8]。本研究结果表明， PC－PLC的特异性抑制剂D609能诱导mBMSCs向神经元样细胞分化，并表达神经元的特异性标志物NSE和NF。这些实验结果说明PC-PLC可能参与小鼠骨髓间充质干细胞的神经分化过程。综合我们先前的研究结果，说明PC-PLC调节髓间充质干细胞的神经分化具有一定的普遍性。 研究证实，非毒性水平的ROS可以作为信号分子调控细胞分化[5]。在神经生长因子(NGF)诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞分化为神经细胞过程中需要ROS产生[9]。我们的研究结果表明，ROS可能作为信号分子参与了mBMSCs向神经元的分化过程。但是在此过程中，很多细胞发生死亡。因此，我们改善细胞分化诱导条件，发现在诱导液中添加FGF-2,可以显著升高细胞的存活率。同时，我们检测了此种处理条件下ROS的水平变化情况，发现在同时加入D609和FGF-2处理的细胞中，ROS水平与D609单独处理组相比显著降低，说明FGF-2可能通过降低细胞内过高的ROS水平提高细胞的存活率。 总之，D609能诱导mBMSCs分化为神经元样细胞，说明D609诱导骨髓间充质干细http://www.paper.edu.cn - 5 - 胞向神经元分化的作用具有一定的普遍性。分化过程中ROS水平明显升高，表明ROS可能参与了mBMSC向神经元样细胞分化的过程。在诱导液中添加FGF-2可适当降低细胞内ROS水平，提高分化细胞的存活率。
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