《上海生物医学工程》杂志２００５年第２６卷第４期　·２０５·　

两种体外细胞毒性检测方法的比较研究＊　

黄哲玮　孙皎孟爱英　

上海交通大学医学院附属第九人民医院／上海生物材料研究测试中心　（上海２０００２３）　

【摘要】　目的　比较两种常用的细胞毒性检测方法在医疗器械生物学评价中的相关性。方法　分别采　

用Ｍ，ｒｒ比色法和细胞增殖度法，在３７℃条件下，将五种医疗器械／生物材料的浸提液分别与小鼠成纤维细胞　

（Ｌ一９２９）接触２天和２，４，７天，比较材料对细胞的毒性影响。结果５种不同的材料浸提液分别表现出不同　

程度的细胞毒性反应（０～２级）。将ＭＴＴ比色法与细胞增殖度法（２天）的实验数据进行相关性分析，显示两　

者之间具有良好的相关性（Ｒ＝０．９７７）。结论ＭＴＴ比色法由于其检测所需的细胞量相对较少，试验步骤相　

对简便、检测周期短，因此具有一定的优越性，是个值得推荐的细胞毒性检测方法。　【关键词】　体外　细胞毒性ＭＴＴ比色法细胞增殖度法　

Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｔｗｏ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｔｅｓｔｓ　

Ｈｕａｎｇ　Ｚｈｅｗｅｉ　Ｓｕｎ　Ｊｉａｏ　Ｍｅｎｇ　Ａｉｙｉｎｇ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ—Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｎｏ．９　ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｓｔ　Ｃｅｎｔｅｒ　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｗｈｉｃｈ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅ—　

ｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｄｅｖｉｃｅ．ＭｅｔｈＯｄ　Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　５　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｄｅｖｉｃｅｓ／ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｔａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　

ｔｈｅ　Ｌ一９２９　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　２ｄａｙｓ　ａｎｄ　２，４，７ｄａｙｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｔ　３７℃ｂｙ　ｔｈｅ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｈｅ　ｃｙ—　

ｔｏｔｏｘｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，５　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｄｅｖｉｃｅｓ／ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｇｒａｄｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（０２ｇｒａｄｅｓ）．ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＭＴＦ　ａｓｓａｙ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｔ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ（２　ｄａｙｓ）ｓｈｏｗｅｄ　

ａ　ｇｏｏｄ　ｒｅｌａｔｉｖｉｔｙ（Ｒ＝０．９７７）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｗｈｅｎ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ，ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ｎｅｅｄ　ｌｅｓｓ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ，ｂｅ　ｍｏｒｅ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｓｈｏｒｔｅｒ，ｉｔ　ｉｓ　ｗｏｒｔｈ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｄｅｖｉｃｅｓ／ｂｉｏｍａ—　

ｔｅｒｉａｌｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ；Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＭＴＴ　ａｓｓａｙ；ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　

生物医用材料及制品已被大量应用于临床　各　

个学科。由于这些生物医用材料及制品在应用中都　

会与人体的组织和细胞发生直接接触，因此它们不　

仅需要有良好的理化性能，而且还必须具备有良好　的生物相容性…。保证这些医用生物材料的安全性　

问题已越来越受到各国政府的重视。１９９２年国际　标准化组织发布的ＩＳＯ　１０９９３医疗器械的生物学评　

价等系列国际标准＿２　Ｊ，我国在７０年代后期开始研究　

生物材料和医用装置的生物学评价方法，从而保证　

上海市重点学科（特色学科）建设项目资助（Ｔ０２０２）　了我国医用生物材料和医疗器械在研究、生产和临　床使用中的安全性，促进了医用生物材料研究的发　

展和水平的提高。在众多的生物相容性试验中，细　

胞毒性试验以其简便、快捷、灵敏性高、节省动物等　优点均被列为首选试验项目，作为评价材料毒性的　

重要指标。　细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体　

生长环境，检测生物医用材料及制品或其浸提液对　

细胞溶解（细胞死亡）、抑制细胞生长和其他毒性作　

用的方法。在Ｉ

ＳＯ　１０９９３—５：１９９９中该项试验可分　维普资讯 http://www.cqvip.com ２０６·　《上海生物医学工程》杂志２００５年第２６卷第４期　

为浸提液方式法、直接接触法和间接接触法三种＿３］。　

目前绝大多数医疗器械及材料是通过浸提液来进行　检测的＿４　Ｊ。其中细胞增殖度法和ＭＴＴ比色法是目　

前最为常用的浸提液试验，通过材料的浸提液与培　

养的细胞广泛接触，可分析材料中各组成成分及其　

浓度对细胞的毒性影响。本次试验试图通过运用这　两种方法对同种材料检测所得到的结果进行相关性　

分析，探讨这两种方法之间是否具有相关性，为今后　

医疗器械／生物材料体外细胞毒性检测方法的选择　

及标准化提供一定的依据。　

１材料　

１．１试验材料　本次试验选用了５种医疗器械／生物材料，其名　称和来源见表１：　表１材料的名称及来源　

１．２试验用细胞系　

小鼠成纤维细胞Ｌ一９２９，购自中国科学院上海　

生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。　

１．３主要试验用试剂　

ＭＴＴ，Ｆｌｕｋａ公司；细胞培养液ＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ公司；　

胎牛血清，上海生物制品研究所；ＤＭＳＯ；结晶紫罗兰等。　

１．４仪器　ｗｅｌｌｓｃａｎ　ＭＫ３酶标仪，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ中国集团制造；　

二氧化碳培养箱，日本ＳＡＹＡＮ公司；９６孔细胞培养　

板等。　２实验方法　２．１材料浸提液的制备　根据ＩＳＯ　１０９９３—５和ＩＳＯ　１０９９３—１２［　，按一定　

比例含小牛血清的细胞培养液，置于３７℃培养２４ｈ。　

２．２细胞悬液的制备　

将传代培养４８ｈ的Ｌ一９２９细胞，用细胞培养液　

分别制备成４×１０５个／ｍｌ和１×１０５个／ｍｌ的细胞悬　

液备用。　２．３细胞增殖度法　将４×１０５个／ｍｌ细胞悬液分别注于试管内　（１ｍｌ／管），置３７℃二氧化碳培养箱中培养２４ｈ。　

２４ｈ后，每管舍弃原培养液，各对照组分别用相应　的对照液进行交换，试验组用含５Ｏ％（Ｖ／Ｖ）浸提　

液的新鲜培养液进行交换，置３７℃二氧化碳培养　

箱中继续培养。分别于２、４、７天将对照组和试验组　各６管取出，丢弃原细胞培养液，用磷酸盐缓冲液　

（ＰＢＳ）洗涤，甲醛溶液固定后，加结晶紫罗兰染色。　最后加入十二烷基硫酸钠，用分光光度计在波长为　

５８８　ｎｍ下测定吸光度值，并根据其吸光度按公式计　

算细胞的相对增殖度（ＲＧＲ）。　

ＲＧＲｃ％　＝弓三　彗　拿　矗　｛　×　ｏｏ％　

２．４　ＭＴＴ比色法　将１×１０　个／ｍｌ细胞悬液接种于９６孔细胞培　

养板（１００ｔＡ／￣Ｌ），置３７℃二氧化碳培养箱中培养２４　

ｈ。等细胞贴壁生长后，去除上清液，加入相应的对　

照液，试验组用含５Ｏ％（Ｖ／Ｖ）浸提液的新鲜培养　液进行交换，置３７℃二氧化碳培养箱中继续培养。　

于２天后取出，加入ＭＴＴ液继续培养４小时。吸除　

原液，加入ＤＭＳＯ，振荡１０ｍｉｎ。用酶联免疫检测仪　

在波长为６３０ｎｍ下测定其吸光度值，根据上述公式　计算细胞的相对增殖度（ＲＧＲ）。　

２．５　根据细胞相对增殖度来评定细胞的毒性反　

应＿６　Ｊ，见表２：　表２细胞毒性反应评定．　

反应　相对增殖度ＲＧＲ（％）　０级　１级　２级　３级　４级　５级　≥１００　７５—９９　５０—７４　２５—４９　ｌ一２４　０　

２．６相关性分析　

将ＭＴＴ比色法与２天时的细胞增殖度法结果　

进行相关性分析。　３　结果　两种检测方法对５种材料细胞毒性试验的检测　

结果见表３：　

将两种检测方法（２天）的细胞相对增殖度结果　

进行相关性分析，得出相关系数Ｒ＝０．９７７，显示两　

种方法之间存在良好的相关性（见表４）。

　维普资讯 http://www.cqvip.com 《上海生物医学工程》杂志２００５年第２６卷第４期　．２０７．　

表３细胞增殖度法和ＭＴｒ比色法测得的细胞相对增殖度　结果（ＲＧＲ）　

表４两种方法检测结果的相关性比较　

４讨论　根据目前国内外医疗器械生物学评价的标准，　

利用体外细胞毒性试验从细胞水平去观察材料是否　

具有细胞毒性即材料对细胞的数量、形态及分化的　影响是检测材料生物相容性的一项重要指标ｌ＿＿　。　

其中浸提液试验因具备材料的浸提液容易获得、便　

于过滤灭菌，并且浸提液与细胞接触广泛等优势被　

大量运用于生物医用材料及制品的细胞毒性检测。　

细胞增殖度法是我国自八十年代就开始运用的　

细胞毒性试验，已广泛应用于目前医疗器械的生物　

安全性评价中。该方法的原理主要是将细胞接触材　

料浸提液后，对存活细胞的数量进行测定，细胞增殖　率来推断材料对细胞的毒性作用Ｅｓ］。ＭＴＩ＂比色法的　

原理是活细胞中的线粒体脱氢酶将３—２（４，５一二　

甲基噻唑一２）一２，５一二苯基四氮唑溴盐还原，产　

生紫色结晶物，用二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）溶解，用酶联　免疫检测仪测定其光密度，通过与对照组的比较得　

到实验组的增殖率，从而评价受试样品的细胞毒　性。ＭＴＩ＂是一种淡黄色唑氮盐，１９８３年Ｍｏｓｒｏａｎｎ根　

据活细胞在能量代谢中，线粒体内琥珀酸脱氢酶将　

Ｍ＇ＩＴ还原产生甲瓒，而在毒性环境中，其琥珀酸脱　

氢酶活性会降低的原理，利用Ｍ＇ＩＴ比色分析法测定　细胞的活性和代谢功能。该方法简便、灵敏，已广泛　用于多种学科领域。近几年来也有报道用于医疗器　

械的细胞毒性检测。　在医疗器械的生物学评价中，有关细胞毒性试　

验国内外基本上都参照ＩＳ０１０９９３．５的标准，其中浸　

提液试验方法我国以往比较多的是采用细胞增殖度　

法，近年来ＭＴＩ＂比色法也逐渐用于生物材料的细胞　毒性的检测，然而，这两种方法获得的结果是否存在　

差异？两者的相关性究竟如何？这是目前医疗器械　

／生物材料的细胞毒性评价中尚无法回答的问题。　

本研究通过对五种材料进行ＭＴＩ＂比色法与细胞增　殖度法两种方法的直接比较，显示了两者之间存在　

良好的相关性（Ｒ＝０．９７７），这为今后医疗器械／生物　材料的细胞毒性试验的方法选择和标准化工作提供　

了重要的科学依据。研究结果提示：ＭＴＴ比色法因　

其检测所需的细胞量相对较少，试验步骤相对简便，　误差小、检测周期短等优点，比细胞增殖度法更具有　

定的优越性，值得推荐（Ｒ＝０．９７７）。　

参考文献　

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