・小专论・脂肪组织源性干细胞研究进展3

李惠侠　屈长青　罗　肖　杨公社△(西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100)摘要　增加具有完整功能的种子细胞数目是细胞移植的首要环节。近来研究发现,成体动物脂肪组织中含有大量的具有多向分化潜能的间充质干细胞,在特定条件下可分化为多种组织细胞,如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞及神经星状细胞等,且具有极强的自我复制能力,有望成为组织工程理想的种子细胞。本文综述了脂肪组织源性干细胞(ADSCs)的发现、生物学特性、多向分化潜能、应用前景及存在的问题。关键词　脂肪源性干细胞;细胞分化;组织工程中图分类号　Q81

白色脂肪组织在哺乳类动物整个生命过程中始终处于动态变化之中,不仅在机体整个能量调节中发挥重要作用,而且在胰岛素抵抗和2型糖尿病的发病机制中占有重要地位[1]。随着组织工程的迅速发展,Zuk等[2]2001年首次从人脂肪组织中发现了大量类似于干细胞的细胞,这些细胞在合适诱导剂的作用下可向成骨、软骨、脂肪和成肌等细胞分化。这样,对脂肪组织的研究不再局限于脂肪细胞。这些具有多向分化潜能的干细胞被称为脂肪组织源性干细胞(adipose2derivedstemcells,ADSCs)。一、ADSCs的发现2001年以来,随着脂肪基质细胞分离和培养技术的完善,人们发现脂肪组织中除了能向脂肪与脉管细胞分化的细胞外,还存在着一些与骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BM2SCs)相似的具有多向分化能力的细胞。不同文献中,分别命名为抽脂处理细胞(processedlipoaspiratecells,PLA),脂肪基质微管碎片细胞(stromal2vas2cularfractioncells,SVF),脂肪组织源基质细胞(adi2pose2tissuederivedstromalcells,ATSCs),脂肪源中胚层干细胞(adipose2derivedmesodermalstemcells,ADMSCs)等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。Guilak等(2006)分离了人SVF细胞,然后通过细胞表面标记选择单一来源的ADSCs,传4代单克隆培养扩增细胞。出现45个克隆时在特异性诱导剂诱导下,发现可以向成脂、成骨、软骨和神经原细胞等分化。其中成骨分化率为48%,软骨43%,神经元细胞占52%,12%为脂肪细胞。进一步证明了ADSCs确实有多向分化潜能,是一类重要的成体干细胞。目前已经证实从人、鼠、猪及兔子等不同物种脂肪组织中均可获得这种细胞,本文通称这种细胞为ADSCs。二、ADSCs的优点及分子标记从人类医学角度讲,获取ADSCs比BMSCs容易,给患者带来的痛苦小。皮下脂肪切除术是一种普通的外科手术,其安全性高。其次,脂肪组织比骨髓中所含的间充质干细胞(mesenchymalstemcells,

MSCs)比率大。成纤维细胞集落形成单位(fibro2blastoid2likecolonies,CFU2F)试验表明,脂肪组织中干细胞数目至少是骨髓的500多倍[3]。我们以鼠和猪为实验动物,胶原酶消化获得大鼠腹股沟及仔猪肩胛部ADSCs,体外培养观察到ADSCs为梭形、呈平行排列;经过多次传代,细胞增殖速度无明显减慢,衰老和死亡细胞所占比例少,表明脂肪组织蕴含丰富的ADSCs。最后,从经济和社会效益看,从脂肪组织中获取ADSCs可将原本认为是废弃物的脂肪,

如临床上脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后废弃的内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源,具有极大的经济与社会效益。一般认为ADSCs与BMSCs具有相似的生物学特性。ADSCs和BMSCs均表达4种通用多向分化潜能干细胞标记CD105、STRO21、CD166及CD117。其中CD117是一种干细胞因子受体,在全能或多能

3国家重点基础研究发展计划(973计划)(2004CB117506)

资助课题△通讯作者

・921・生理科学进展2007年第38卷第2期干细胞中表达,包括ESCs。除了上述几种标记外,ADSCs和BMSC也表达其他多种分子标记,包括CD29、CD44和CD49e等(表1)。表1　ADSCs和BMSCs表面标记比较[4]表面标记ADSCsBMSCsCD9++CD10++CD13++CD29++CD3122CD3422CD44++CD4522CD49d+2CD49e++CD54+++CD55++CD59++CD90++CD105++CD1062+CD117++CD146++CD166++STRO21++三、ADSCs的多向分化潜能Zuk等用0.075%的胶原酶消化人脂肪抽提物30分钟后,得到的ADSCs可诱导向不同细胞分化。Cousin等(2003)采用0.2%胶原酶II型+0.2%BSA消化C57B1/6小鼠腹股沟皮下脂肪45分钟后,得到的细胞可重建致死辐射小鼠的造血系统。Rangappa等(2003)采用胰酶、胶原酶+BSA联合消化新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪2.5小时,得到的ADSCs,在52氮胞苷作用下可向心肌细胞分化。我们用0.1%胶原酶I型消化猪肩胛部和皮下脂肪,发现获得的ADSCs在合适诱导剂下至少也可以向脂肪、成骨和肌细胞分化[5](成肌文献待发表)。综合近几年的研究,ADSCs可向脂肪、软骨、成骨、神经元细胞、成肌细胞、血管内皮细胞等方向分化。其中脂肪、成骨、软骨和成肌细胞为中胚层来源细胞,而造血细胞和肝实质细胞的分化目前文献较少,需进一步研究证实(图1)。图1　脂肪组织来源干细胞向多种细胞分化(一)向脂肪细胞分化　在ADSCs基础培养基

(DMEM/10%FBS)中加入不同浓度的32甲基212丁

基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和噻唑烷二酮进行诱导培养。3～10天后,经油红O或尼罗红染色,发现部分细胞中充满被染成红色的脂滴,表达脂肪酸结合蛋白(aP22)、脂蛋白酶(LPL)和过氧化物酶体增殖物激活受体2γ2(PPARγ2)。在多种动物模型(鼠、猪)中注入已分化或未分化的ADSCs,并配合不同的生物材料,如藻酸盐、透明质酸、纤维胶、多聚乳酸等,均能形成脂肪。我们的研究发现,从不同物种不同部位提取的ADSCs,其成脂诱导物可能存在差异:

大鼠腹股沟脂肪基质细胞在不加任何诱导物的基础培养基中培养5～10天,显微镜下观察到80%以上细胞充脂;猪的肩胛部和皮下脂肪基质细胞需要在成脂诱导剂作用下分化。随着传代次数的增加,二者成脂分化率均降低。因此认为原代细胞中可能含有较多的前体脂肪细胞,传代可以去除脂肪,使AD2SCs纯度增加。(二)向成骨方向分化　ADSCs在成骨方面的

研究已取得了相当快的进展。人、鼠和猪ADSCs在有VC、β2甘油磷酸、地塞米松和1,252VD3的培养基中诱导,ADSCs由狭长的类成纤维细胞形态转变为圆形、立体形状。2～4周可在细胞外基质中形成磷酸盐钙化沉积物,并表达骨原性基因和蛋白质,如碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OC)和胶原蛋白2I等。Dragoo等[6]给ADSCs转染骨形成蛋白22(BMP22),成骨分化速度快于培养基中添加重组人BMP22蛋白。比较转染BMP22基因的

・031・生理科学进展2007年第38卷第2期MSCs和ADSCs发现,后者可产生更多的骨祖细胞和细胞外钙化基质成分,成骨分化率为45%。Shi等(2005)研究表明,ADSCs的成骨分化能力不受动物年龄限制,是一种理想的骨种子细胞。(三)向软骨方向分化　用含胰岛素、TGF2β1和22磷酸抗坏血酸的软骨诱导液培养ADSCs,2～4周后ADSCs表现软骨细胞形态,并表达软骨特异性标记Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等,角质素阿辛蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性[7]。Masuoka等(2006)以蜂巢状胶原生物支架复合软骨诱导的大鼠AD2SCs,植入膝关节软骨严重缺陷处,12周后发现受损软骨得到修复,并表达II型胶原。(四)向成肌方向诱导　Mizuno等(2002)在加入马血清的培养基中,大约有15%的ADSCs细胞诱导6周后表达肌肉特异性标志因子如MyoD1和肌细胞生成素,骨骼肌转录调节因子myf5、myf6等。最终,细胞融合形成多核的肌管,并表达骨骼肌细胞谱系的标志蛋白如肌球蛋白轻链激酶,说明ADSCs可向骨骼肌方向分化。Bacou等(2004)用LacZ标记培养3天的ADSCs,自体移植到胫骨前肌肉损伤部位,2个月后发现大块新生肌肉断面。如果延长ADSCs体外培养时间到7天,导致肌肉修复能力降低。尽管ADSCs向肌肉方向分化与其向脂肪组织和成骨方向分化的水平相比较低,但通过应用一些外源性的因素进行干扰以及改善培养条件有希望提高ADSCs向成肌细胞分化的水平,提高其临床应用价值。(五)向心肌方向诱导　Rangappa等(2003)分离新西兰大白兔ADSCs,传2代加入不同浓度52氮杂胞苷诱导培养2周,细胞形态逐渐向圆形转变,而对照组仍表现为纤维样的细胞。3周后细胞出现自发性搏动,2个月后免疫组化染色证明表达心肌特异性蛋白如肌钙蛋白、α2肌球蛋白重链、肌节蛋白、连接素,证实ADSCs有向心肌分化的潜能。以大鼠心肌细胞提取物(CEs)短期处理人ADSCs,结果也表达上述心肌特异标志物以及连接蛋白243(Cx243)[8]。Strem等(2005)将分离的Rosa26小鼠(转β2牛乳糖基因鼠)ADSCs注入心肌缺损鼠(非转β2牛乳糖基因鼠)心室内,手术后7、14天后检测到β2牛乳糖标记的心肌细胞。(六)向神经细胞分化　早期,用β2巯基乙醇诱导8小时,可使ADSCs快速表现神经元以及神经胶质细胞形态(细胞体积缩小,周围有多个神经突起),并表达早期神经系统标志物,包括巢蛋白(nes2tin)、神经元特性烯醇化酶(NSE)和神经元特异核

蛋白(NeuN)。Ashjian等(2003)以替代诱导液IB2MX、吲哚美辛和胰岛素诱导2周后,大约20%～25%的人ADSCs分化形成具有神经细胞形态特征的细胞。但是,诱导后的细胞只限于早期神经标志,并没有发现神经元树突标志物微管相关蛋白(MAP)和成熟星形细胞标记物胶质纤维酸性蛋白

(GFAP)。一种解释认为,这些早期神经标志物的

出现是毒性刺激物诱导下基因表达异常的结果;另一种解释认为,现有的诱导剂不能使ADSCs和MSCs充分表现神经分化特性,只能部分表达神经细胞特性。动物活体移植试验证明了后一种解释的正确性:Kang等(2003)直接将ADSCs移植到大鼠大脑内,植入后14天检测到4%的移植细胞表达MAP22,9%表达GFAP,表明ADSC向成熟神经方向分化。但到目前为止,还未见资料证明ADSCs能分化成具有完全功能的成熟神经细胞,以及参与中枢神经系统的整合和修复。(七)向其他类型细胞分化　除上述几种细胞