The effect of epidermal growth factor (EGF) conjugated with low-molecular-weight protamine (LMWP) on wound healing of the skin
Reporter：Yangxiang 14/11/2012
一个月后
伤口愈合是一个交互式的，动态的，持续不断的过程，它 涉及到炎症的发生，细胞的增殖以及组织的再生。 影响因子：血管内皮生长因子，血小板生长因子，表皮生 长因子等。
EGF：表皮生长因子(epidermal growth factor)
EGF是一种由53个氨基酸组成的多肽
EGF：表皮生长因子(epidermal growth factor)
• Result 4
rLMWP-EGF在生物活体模型中的影响
利用无毛小鼠的伤口模型来评估rLMWP-EGF在活体中的功效。通过 与对照组比较，rEGF和rLMWP-EGF的治疗都显著地减少了伤口面积。 从第4天开始，另一个明显的差异出现，即rLMWP-EGF在相同浓度 下能更强的加速伤口愈合。
• Result 5 rLMWP-EGF在糖尿病伤口模型中研究
SC：stratum corneum
角质层
角蛋白
减少水份蒸发， 使皮肤保持湿润
SC：stratum corneum
角质层
角蛋白 角质层有许多层的 很薄的脂双层所形 成的疏水作用。 减少水份蒸发， 使皮肤保持湿润
PTD(protein transduction domain)-based delivery technology
肿瘤细胞 意大利胚胎学家 Rita-Montalcini
1986年诺贝尔生理医学奖
EGF：表皮生长因子(epidermal growth factor)
“美丽因子”
EGF：表皮生长因子(epidermal growth factor)
“美丽因子” 局限性
只有在伤口区域维持高浓度的EGF，才能有较 高的皮肤渗透率和比较高的生物活性。
Thank you
• A. rLMWP-EGF与其他PTD的积累穿透浓度比较研究
为了评估很多PTD的穿透皮肤的能 力，以及其积累浓度。实验中用 标示了Alexa Fluor 555荧光剂的EGF （ Alexa Fluor 555 EGF）在人造3D 皮肤表皮构造上进行了一个对照 穿透研究。 ①Alexa Fluor 555 EGF ②LMWP+Alexa Fluor 555 EGF ③LMWP-Alexa Fluor 555 EGF ④TAT-Alexa Fluor 555 EGF ⑤R7-Alexa Fluor 555 EGF
A. 将LMWP连接到EGF的N末端， 在E.coli中构建了一个能够过表 达LMWP-EGF的质粒
B. rLMWP-EGF蛋白在大肠杆菌 BL21 DE3菌株中表达后。利用 排阻色谱和离子交换色谱提纯 rLMWP-EGF。每一步提纯的蛋 白质都用SDS-PAGE分析。
• Result 1 表达载体的构建以及重组LWMP-EGF的 表达与提纯
• D. 离体小鼠皮肤rLMWP-EGF的穿透能力研究结果。
分别研究rEGF和rLMWP-EGF在1,3,6,9,12,24h的累积渗透量
关键词
约31个氨基酸
非常高的精氨酸含量
LMWP的序列
VSRRRRRRGGRRRR
精氨酸的R基团含有胍头基团
通过胍头基团的氢键作用与细 胞膜上的磷脂相互作用可以增 强富含精氨酸的多肽在细胞中 转运。
如何获取LMWP-EGF？
1.是通过酶促降解鱼精蛋白，经过分离纯化后得到 LMWP，再化学连接到EGF上。
2.通过基因重组技术将LMWP连接到EGF的N末端来 制取LMWP-EGF。
获得rLMWP-EGF的后续研究
1.利用细胞增殖实验对其生物活性进行检测。
①离体的皮肤组织模型
②人造皮肤组织模型
2.渗透率研究
③生物活体皮肤组织模型
④糖尿病生物活体皮肤组织模型
• Result 1 表达载体的构建以及重组LWMP-EGF的 表达与提纯
Conclusions
• 在本研究中，将一个带强正电荷的LMWP连接到 EGF的N末端而产生的LMWP-EGF具有和rEGF相当 的生物活性，并在离体试验中明显地提高了皮 肤渗透率。 • 另外，在活体伤口以及糖尿伤口模型中，局部 应用rLMWP-EGF显著加快伤口愈合，这很可能就 是因为增强了皮肤的渗透率。 • 因此，我们可以认为rLMWP-EGF可以在伤口愈合 产品中被用作为一种活性剂，而且它可能会和 其他经皮给药系统产生协同作用。更重要的是， 通过基因重组将LMWP特异性定点连接到多肽或 蛋白质上，将会产生高效的生物医学。
两种机制解释
第一种解释： LMWP序列中VSRRRRRRGGRRRR有10个精氨酸残基。一般认为富含精 氨酸的多肽的细胞转运，是被精氨酸中的胍头基团组通过氢键作用 与细胞膜上的磷脂相互作用以及精氨酸和胞外基质相互作用而调节。 因此，与皮肤细胞外脂质的相互作用可能就是rLMWP-EGF增强皮肤 穿透力的原因。这种相互作用可能导致了原有的有序脂质定位被破 坏，并通过开放的通道形成浓度梯度，最终增强了rLMWP-EGF穿透 SC的能力。 第二种解释： 皮肤中的紧密连接被破坏，可能也是一种对rLMWP-EGF增强穿透生 长皮肤层的解释。
PTD 是 由 中 性 或 者 带 正 电 荷 的 氨 基 酸 例 如 精 氨 酸或赖氨酸构成。
带正电荷的精氨酸残基与带负电的脂质层相互作用， 可以增强多肽和蛋白质对脂双层的穿透力。
LMWP：low-molecular-weight protamine
Protamine (鱼精蛋白)
鱼类及哺乳类成熟精巢组织 阳离子肽
A. 将LMWP连接到EGF的N末端， 在E.coli中构建了一个能够过表 达LMWP-EGF的质粒
B. rLMWP-EGF蛋白在大肠杆菌 BL21 DE3菌株中表达后。利用 排阻色谱和离子交换色谱提纯 rLMWP-EGF。每一步提纯的蛋 白质都用SDS-PAGE分析。
• Result 1 表达载体的构建以及重组LWMP-EGF的 表达与提纯 利用Bandscan软件对泳道进行密度测定得知蛋白含 量为98%。 利用蛋白质测序仪来确定纯化后的rLMWP-EGF的N 末端氨基酸。分别得到rLMWP-EGF和rEGF的N端序 列和理论序列相一致。
利用不同浓度是rEGF和rLMWP-EGF对引入糖尿病的小鼠伤口进行实 验，并与空白对照组进行对比。
Discussion
PTD的皮肤穿透能力准确的机制还不清楚。 最近的研究已经证明了基于PTD的多肽和蛋白质是通过巨细胞内吞 作用进入细胞的。 但是富含精氨酸的细胞间传递蛋白的这种经皮给药机制貌似和这种 内吞机制不同。 这是因为SC的细胞间的脂质区域和细胞膜不同，不仅仅是在脂质组 分上不同，并在含水量和脂水比上不同。 另外，皮肤的最外层是由死细胞组成，内吞作用是不可能发生的。 然而，PTD与脂质的相互作用可能对穿过SC很重要。通过细胞间脂 质与PTD的相互作用，解除了皮肤中的紧密连接，而由此产生的梯 度，可能就是导致大分子穿透皮肤的动力。
rEGF在0.1ul和1.0ul时细胞 增殖显示出123%和146% 的增长。
• Result 3 离体皮肤渗透研究
A. rLMWP-EGF与其他PTD的积累穿透浓度比较研究
B. rLMWP-EGF穿透效率与浓度关系的研究
C. rLMWP-EGF的皮肤穿透能力的增强是否与细胞 毒性有关 D. rLMWP-EGF的穿透能力研究
同 时 也 可 以 确 认 EGF 的 N 末 端 特 异 性 的 结 合 到 LMWP上。
• Result 2
rLMWP-EGF的生物活性评估
将NIH3T3细胞（mouse fibroblast cell line)）与添 加了rEGF和rLMWP-EGF的 组进行对比，然后检测细 胞的增殖。 rLMWP-EGF为0.1ul和1.0ul 时，细胞的增殖率分别为 128%和143%，高于对照 组。

B. rLMWP-EGF穿透效率与浓度关系的研究结果
在给药24小时后，分别研究rEGF和rLMWP-EGF在装载浓度为 0.5ul,2ul,5ul和10ul时候的积累穿透浓度。
• C. rLMWP-EGF的皮肤穿透能力的增强是否与细胞毒性 有关的研究结果
在不同浓度下的rEGF和rLMWP-EGF后处理进行MTT实验来检测细胞 生存能力。
EGF是一种由53个氨基酸组成的多肽 factor ） NGF：神经生长因子（nerve growth 美国生化学家 Stanley Cohen
肿瘤细胞 意大利胚胎学家 Rita-Montalcini
EGF：表皮生长因子(epidermal growth factor)
NGF：神经生长因子（nerve growth factor ） 美国生化学家 Stanley Cohen