疫苗佐剂CpG ODN的研究进展 摘要：CpG ODN是指含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列的核苷酸序列，人工合成的CpG ODN是根据细菌DNA的结构特性及免疫特性而定的。CpG ODN通过TLR9可以直接激活B细胞和树突细胞引起直接的Th1型免疫反应。CpG ODN因其可以提高疫苗的反应速度，增强疫苗的反应强度以及免疫耐受力而被认为是一种有效的佐剂。例如CpG ODN联合OVA免疫可以明显的提高AVA的抗感染能力。CpG ODN联合多种疫苗均可以增强相应的体液免疫和细胞免疫，同时增强灵长类和啮齿类对病毒的抵抗能力。临床试验证明CpG ODN是一种对人类安全有效的佐剂，可以增强对疫苗的特异性反应。 关键词：CpG ODN；作用机制；佐剂；黏膜佐剂 Abstract：Synthetic oligodeoxynucleotides (ODN) containing unmethylated CpG motifs mimic the immunostimulatory activity of bacterial DNA. CpGODN directly stimulate B cells and plasmacytoid dendritic cells (pDC),promote the production of Th1 immune responses through Toll-like receptor 9. CpG ODN are finding use as vaccine adjuvants,where they increase the speed,magnitude and duration of vaccine-specific immune responses. For example, CpG ODN significantly prolong the protection induced by AVA (Anthrax Vaccine Adsorbed). Co-administering CpG ODN with a variety of vaccines has improved the resultant humoral and/or cellular immune responses, culminating in enhanced protective immunity in rodent and primate challenge models. Ongoing clinical studies indicate that CpG ODN are safe and well-tolerated when administered as adjuvants to humans, and that they can support increased vaccinespecific immune responses.

Key Words：CpG oligodeoxynucleotides；Mechanism；Adjuvant；Mucosal adjuvant

免疫佐剂概念最早在1924年由Ramon提出，至今已有近百年的深入研究，但是临床应用的疫苗佐剂还仅限于几种如弗氏佐剂，铝佐剂等，人用疫苗佐剂主要还是铝胶佐剂。新型佐剂的开发利用已成为现代疫苗研究中一个非常重要的领域。 CpG ODN是指具有免疫刺激作用的含非甲基化的CpG寡居核苷酸的DNA序列。1984年，Tokunaga等人[1]首次发现结核分枝杆菌的DNA除了是一种遗传物质外， 还具有抗肿瘤特性。1995年，Krieg等人[2]证实这些DNA中含有的非甲基化的CpG基序是与其免疫激特性密切相关的结构。随后，Tokunaga等人通过研究发现：以未甲基化CG二聚核苷酸为核心的特定核苷酸序列是DNA具有免疫学活性的重要特性，免疫系统通过对这些特定序列的识别来诱发免疫应答。Krieg等人认为使CpG具有强的免疫刺激作用的充要条件：（1）碱基数目不能少于8个，否者不能引起免疫刺激。(2)CpG核心序列的两侧需要2个5，嘌呤和2个3，嘧啶，且当5端为GpA、3，端为TpC或TpT时活性最强。（3）硫代磷酸酯修饰后的CpG，因增强了CpG ODN抗核酸酶降解的能力，延长了其半衰期，而相应的增强其免疫活性。CpG ODN既存在于细菌病毒等原核生物中，又存在于脊椎动物中。但是该序列在病毒和原核生物基因组中出现的频率远高于脊椎动物，且脊椎动物中60%--90%的胞嘧啶通常是甲基化的，这种差异使脊椎动物的免疫系统把未甲基化的CpG ODN作为一种免疫原，并通过特定受体诱导增强免疫反应。本文就CpG ODN的作用机制以及其作为佐剂增强系统免疫和黏膜免疫的研究进展做一简单综述。 1、 CpG ODN的生化特征及其作用机制 CpG ODN是由含未甲基化的CpG二核苷酸为核心的回形序列组成，其基本骨架为5’-PuPuCGPyPy-3’。 2 CpG ODN的结构和分类 通常CpG ODN的每一条DNA单链具有2～4个CpG双核苷酸，每条主链有两种磷酸化的修饰方式：磷硫酰(phosphorothioate，PTO)主链或磷酸二酯(phosphodiester，PO)主链。每种CpG ODN的结构和免疫激活作用均不同。根据CpG ODN的结构及其对不同免疫细胞的激活作用，可将CpG ODN分为3类。[abc] (1)A型CpG ODN(A-Class CpG ODN，CpG-A ODN)也称D型CpG ODN：在ODN的3’和5’末端主要由PO主链及PTO多聚G序列构成。CpG-A ODN可以刺激浆细胞样树突状细胞产生大量α干扰素进而激活NK细胞并引起γ干扰素的分泌。但CpG-A ODN对刺激B细胞活化的作用较弱。(2)B型CpG ODN(B-Class CpG ODN，CpG-B ODN)也称K型CpG ODN：CpG-B ODN完全由PTO主链构成，有很强的刺激B细胞活化的作用但刺激浆细胞样树突状细胞产生α干扰素的作用较弱。(3)C型CpG ODN(C-Class CpG ODN，CpG-C ODN)：CpG-C ODN也完全由PTO主链构成，兼具CpG-A ODN和CpG-B ODN的作用。Kanellos等[4]通过研究发现脊椎动物免疫识别系统对CpG基序的识别有一定的差异。通过改变化学结构和碱基等，人工合成的CpG ODN 结合了三种类型的优点,同时客服了种属间的差异。 免疫应答的过程即病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）与天然免疫细胞上的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）相结合，从而激活免疫应答的过程。细菌CpG ODN便是一个PAMP，其受体是PRR中的一种Toll样受体9(TLR9)。TLR9存在于B细胞，巨噬细胞等免疫细胞的内质网内表面中，但是T细胞中不存在这种TLR9。因此，CpG ODN可以引起直接的Th1型免疫反应，通过细胞因子，IFN—α等可以引起间接的Th2型免疫反应。 2 、CpG ODN提高抗原的免疫原性 2.1 CpG ODN提高蛋白的免疫原性 Klinman[5]等通过研究表明以CpG ODN作为佐剂提高蛋白抗原（如卵清蛋白）的免疫原性约3倍。当用OVA和CpG ODN免疫时，因其固着时间短免疫力低。联合OVA和CpG ODN在不完全弗氏佐剂中孵化后免疫IgG提高了10倍。通过生物素蛋白或化学桥梁交联OVA和CpG ODN也可明显的提高其免疫原性，而将交联的混合物通过DNＡ消化酶后其免疫原性即消除。另外将CpG ODN的核心序列替换后和OVA交联后其免疫原性亦消除。说明CPG具有很强的佐剂作用。 通过不同的实验证明CpG ODN具有疫苗佐剂的作用。H．xie,I.Gursel[6-7]等将脂质体作为免疫载体把CpG ODN和抗原一同包裹于重组的微体中，免疫后直接与抗原呈递细胞反应，引起高水平的CTL[8]。CpG ODN和抗原结合后可以提高免疫原的作用时间和强度，因此可以提高免疫效率。 2.2 CpG ODN对同源抗体的作用 Klinman[5]等通过研究表明CpG ODN可以引起IgG抗体的IgG1和IgG2a之间的转换。加入CpG ODN后IgG1：IgG2a的比例由原来的7:1变为2.8:1。产生IgG2a抗体的免疫反应增强。不同的抗原如肝炎B表面抗原、流感病毒、破伤风病毒、麻疹病毒、布鲁氏菌、天花的L1和A33蛋白、联合CpG ODN均可以改变IgG1和IgG2a抗体滴度的比例[9]。 2.3 CPG ODN对抗原特异性细胞因子产生的影响 Klinman[5]等人通过研究OVA和CpG ODN的联合作用对抗原特异性细胞因子IFNγ的作用。发现CPG ODN和OVA共免在动物体内产生的IFNγ比单独用OVA免疫高两倍，并且和CpG ODN的量呈剂量效应。用不含CpG核心序列的CpG ODN和OVA共免后IFNγ无变化。此外，CpG ODN能刺激单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）NK细胞，活化表达IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、TNF、IFNα等细胞因子。表现为直接的Th1 型，并在Th1细胞的协同作用下激活细胞毒T淋巴细胞表现为强烈的细胞免疫反应[10]。 3、 CpG ODN作为佐剂的应用状况 因其独特而强烈的免疫激活作用，CpG ODN作为免疫佐剂及免疫治疗药物的研究取得了多方面进展。 3.1 CpG ODN作为疫苗佐剂增强系统免疫反应 CpG ODN作为疫苗的佐剂明显的提高系统的细胞免疫和体液免疫，与疫苗共同作用即可以提高以Th1型反应为主的预防治疗，又因其可以提高CTL，激活细胞因子引起一系列的