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关键词：致病菌；快速检测技术；微生物Ｔｈｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　Ｆａｓｔ　ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＴｅｃｈｉｎｑｕｅ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ＦｏｏｄｓｔｕｆｆＣＨＥＮ　Ｑｉｎ－ｓｅｎｇ１，ＦＥＮＧ　Ｙｏｎｇ－ｑｉａｎｇ２，ＨＵＡＮＧ　Ｂａｏ－ｈｕａ１，ＷＥＩ　Ｇｕｏ－ｘｉａｎｇ１，ＰＡＮＧ　Ｇｕａｎｇ－ｃａｎｇ１，ＨＵ　Ｚｈｉ－ｈｅ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｒｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｏｍｍｅｒｃｅ，　Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１３４，　Ｃｈｉｎａ；　２．Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｈａｉｈｅ　Ｄａｉｒｙ　Ｃｏ．　Ｌｔｄ．，　Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１３４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｔｈｉｓ　ｔｅｘｔ　ｃａｕｓｅｓ　ｔｈｅ　ａｎｇｌｅ　ｏｆ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｅｒｍ　ｍｅａｓｕｒｅｓ　ｆａｓｔ　ｔｏ　ｓｅｔｏｕｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｆｏｏｄ，　ｈａｖｅ　ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｔｏｍｅａｓｕｒｅ　ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｆａｓｔ　ｍｏｒｅ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ，　Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ　ｔｈｅ　ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｈａｓｍｅａｓｕｒｅｄ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｓｐｅｃｔ　ｆａｓｔ　ｉｎ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｉｎ　ｒｅｃｅｎｔ　ｙｅａｒｓ，　Ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｈａｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｔｈｅ　ｅｎｏｒｍｏｕｓｉｍｐｅｔｕｓ　ｔｏ　ｔｈｉｓ　ｆｉｅｌｄ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎ；ｆａｓｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ中图分类号：　ＴＳ２０７．７ 文献标识码：　Ａ 文章编号：１１０２－６６３０（２００３）１１－０１４８－０５收稿日期：２００３－０５－０８作者简介：陈庆森（１９５７－），男，教授，从发酵生物技术及活性蛋白质、酶技术的研究。

随着科学技术水平的日新月异的发展，人类对文明程度的要求越来越高，特别是对危害人类健康的重要的致病微生物。

人类进入２１世纪，一些致病微生物的快速检测技术也得到了迅速地发展［１］［９］［１３］，如：免疫学中的放射免疫分析（ＲＩＡ）、酶免疫分析（ＥＩＡ）［６］、荧光免疫分析（ＦＩＡ）、时间分辨荧光免疫分析（ＴｒＦＩＡ）、化学发光免疫分析（ＣＩＡ）、生物发光免疫分析（ＢＩＡ）等，足以检出临床标本中痕量的（１０－１８～１０－２１）微生物抗原；生物化学中的快速专有酶反应和细菌代谢产物的检测技术；分子生物学方面已经形成了核酸探针（Ｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｂｅ）［２］［５］和聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）［３，４］的检测技术，该技术以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，业已逐步应用于食源性病原菌的检测。

然而传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究，更跟不上人类对致病微生物快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的快速诊断及检测的方法。

本文仅就微生物实验室可常规应用的技术即快速微生物检查法作一介绍。

１以生物化学手段建立的快速检测技术１．１常规的致病微生物的检测技术法国科学家巴斯德（Ｌｏｕｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ，１８２２～１８９５年）首先实验证明有机物质发酵和腐败是由微生物引起，而酒类变质是因污染了杂菌所致，从而推翻了当时盛行的“自然发生说”。

巴斯德的研究，开始了微生物的生理学时代，人们认识到不同微生物间不仅有形态学上的差异，在生理学特性方面亦有所不同，进一步肯定了微生物在自然界中所起的重要作用。

众所周知，不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各异，利用微生物（主要是细菌）的不同生化和生理特性，可以对细菌进行鉴定。

生化鉴定是检测细菌最常用的方法。

细菌检验中的微量化和自动化，是微生物学诊断中的发展方向，经过多年的研究和不断改进，常规的临床细菌学诊断已由系列的试剂盒商品成套供应，来替代各检验部门自行配制试剂，手工操作的缓慢和繁琐状态［９］。

另外，气相色谱和高效液相色谱的分析也应用到致病微生物的检测中，主要是依据不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各异，利用上述色谱检查可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测，其中以气相色谱应用较多。

尽管该法具有简单、快速、可靠，在数小时内即可得出结果的特点，但由于使用的仪器设备相对比较昂贵，所以不适应现场的快速检测，特别是食品加工过程中的ＨＡＣＣＰ中的关键控制点的检测；另外其特异性和低耗也是不明显的。

天津医科大学检验系王金良教授报道了快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套鉴定系统（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ）的技术，该生化反应的成套系统中底物系由色原（呈色）或荧光与糖类或氨基酸人工合成。

此底物无色，经细菌的细胞内或细胞外酶的作用而释放出色原（呈色）或荧光，其优点是特异性强，反应迅速，易于自动化检测，明显提高了细菌生化反应的准确性，实现了细菌生化反应革命性变化。

常用的酶有：糖苷酶和氨基肽酶；呈色的色原有：α、β萘酚、邻位或对位硝基酚、对硝基苯胺、酚酞、２－氨４－硝基苯……；常用的荧光物有：４－甲基伞形酮（４ＭＵ）、７－氨基－４－甲基伞形酮香豆素。

　以此类先进的生化反应底物为基础，已制成各菌属细菌鉴定装置，一次可做１０～４０项试验，反应结果可由人工或仪器判定，在通过编码得出鉴定结果。

先进的细菌自动鉴定系统可在２～６ｈ完成鉴定，就是在鉴定系统中应用了此类色原或荧光底物。

１．２微生物专有酶快速反应系统的检测技术微生物专有酶快速反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。

根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。

这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个主要发展方向。

利用细菌中某些具有特征性的酶，应用适当的底物可迅速完成细菌鉴定。

如沙门氏菌具有辛酸酯酶，以４ＭＵ－辛酸酯酶为底物，经沙门氏菌酶解，在紫外灯下观察游离４ＭＵ的荧光。

卡他莫拉菌具有丁酸酯酶，可用丁酸酯色原底物快速鉴定等。

现将快速鉴定用细菌的特异性酶列于表１。

表１ 致病菌快速诊断用的特异性酶部分微生物种类所具有的特异性酶脑膜炎奈瑟菌γ谷氨酰转肽酶肠球菌吡咯芳胺酶（ＰＹＲ）、亮氨酸氨肽酶（ＬＡＰ）沙门菌辛酸酯酶大肠埃希菌β葡萄糖醛酸酶白色念珠菌脯氨酸氨肽酶、Ｎ－乙酰β－Ｄ半乳糖苷酶热带念珠菌吡咯磷酸酶产单核李斯特菌丙氨酸氨肽酶金黄色葡萄球菌β－　Ｎ－乙酰葡萄糖胺酶腐生，中间，斯氏葡萄球菌β半乳糖苷酶Ａ族链球菌吡咯芳胺酶（ＰＹＲ）难辨梭菌谷氨酸脱氢酶（ＧＤＨ）、脯氨酸酶克柔念珠菌酸性磷酸酶Ｄｅｌｉｓｅ等新合成一种羟基吲哚－β－Ｄ葡萄糖甘酸（ＩＢＤＧ），在β－Ｄ葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的蓝，将一定量的ＩＢＤＧ加入到麦康盖培养基琼脂中制成ＭＡＣ－ＩＢＤＧ平板，３５℃培养１８ｈ，出现深蓝色菌落者为大肠埃希氏阳性菌株。

其色彩独特，且靛蓝不易扩散，易与乳糖发酵菌株区别。

王金良教授等应用β－萘酚辛酯酶为底物，经沙门氏菌酶解，释出β－　萘酚与固兰作用出现紫色，反应在纸片上进行，只需５ｍｉｎ即可完成沙门氏菌的鉴定。

这对食品与环境卫生检验有重要价值。

他们还运用对硝基酚－β－葡萄糖醛酸为底物不仅可快速鉴定大肠埃希菌，尚可在４０５　ｎｍ测定对硝基酚的释放量而定量，检测最低限可达１００ＣＦＵ／ｍｌ。

定量检测在环境与食品卫生检验中极为重要，此法提供一新的手段。

２以免疫学方法建立的快速检测技术免疫检测的基本原理是抗原抗体反应。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

不同的微生物有其特异的抗原并能激发机体产生相应的特异性抗体。

在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测微生物的特异抗原，也可利用微生物抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。