生物技术

TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

刘美英1,2,冶晓芳2,唐益苗2,高世庆2,张󰀁朝1,2,赵昌平2,陈学平1

1中国科学技术大学研究生院,化学系,合肥市金寨路96号230026;2北京市农林科学院,杂交小麦工程技术研究中心,北京市海淀区西郊板井曙光花园中路9号100097

摘󰀁要:NAC(NAM󰀁ATAF󰀁CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答反应中发挥重要作用。通过同源克隆的方法从小麦中分离得到一个编码NAC转录因子的基因󰀁TaNAC,该基因编码的蛋白序列结构特殊,N端为保守性差的NAC保守域,只包含A,B,D3个亚结构域,进化关系上与DREB家族更近,其C端共同享有多个基序。实时荧光定量PCR实验证实TaNAC基因受干旱诱导24h后强烈表达。将该基因构建到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,获得T1代转基因苗。模拟干旱胁迫处理实验表明,过量表达TaNAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能,说明TaNAC基因的过量表达能够提高烟草抗旱能力,TaNAC可以作为烟草抗旱育种的优良候选基因资源。关键词:NAC;转录因子;系统进化树;干旱胁迫;转基因烟草doi:10󰀁3969/j.issn.1004󰀁5708󰀁2010󰀁06󰀁016中图分类号:S572󰀁032󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁文章编号:1004󰀁5708(2010)06󰀁0082󰀁07

EffectsofTaNACondroughtresistanceintransgenictobaccos

LIUMei󰀁ying1,2,YEXiao󰀁fang2,TANGYi󰀁miao2,GAOShi󰀁qing2,ZHANGZhao1,2,

ZHAOChang󰀁ping2,CHENXue󰀁ping1

1DepartmentofChemistry,GraduateSchoolofUniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230026,China;2BeijingEngineeringandTechniqueResearchCenterofHybridWheat,BeijingAcademyofAgricultural

andForestryScience,Beijing100097,China

Abstract:NAC(NAM󰀁ATAF󰀁CUC)transcriptionfactorsplayimportantrolesinvariousstressresponse.Inthisstudy,oneNACgenenamedTaNACencodingaNACproteininwheat(TriticumaestivumL.)wasidentified.TheputativeTaNACpro󰀁

teinstructurewasspecial.TheNterminalDNAbindingdomainconsistedofonlythreesubdomains(A,B,D),whiletheC󰀁

terminalwassimilartotheDREBprotein,sharingseveralmotifs.Real󰀁timePCRconfirmedthatTaNACwasstronglyinducedafter24hunderdroughttreatment.TaNACwasconstructedintoPBI121byconnectionwith35Spromoter;transgenic

seedlingswereobtainedbyAgrobacterium󰀁mediatedgenetictransformationmethod.Comparingtowildtypes,overexpressionof

TaNACgeneshowedsignificantdroughtresistanceintransgenictobaccos.ItalsoindicatedthatTaNACwasexcellentcandi󰀁

dateforplantdroughtbreeding.Keywords:NAC;transcriptionfactor;phylogenetictree;drought;transgenictobacco

作者简介:刘美英,女,硕士,主要研究方向:作物遗传育种,E󰀁mail:liumy@mail.ustc.edu.cn陈学平(通讯作者),男,博士,副教授,主要研究方向为作物遗传育种,E󰀁mail:chenxp08@ustc.edu.cn基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08002󰀁002,2008ZX08002󰀁003,2008ZX08002󰀁004)收稿日期:2010󰀁06󰀁02󰀁󰀁NAC(NAM󰀁ATAF󰀁CUC)转录因子是近十几年来

新发现的具有多种生物功能的植物特异转录调控因

子。Aida等首先报道了NAC结构域,发现矮牵牛NAM

基因和拟南芥ATAF1/2和CUC2基因编码蛋白的N端

均包含一段保守的氨基酸序列,取其首字母命名为

NAC[1]。第1个NAC转录因子由Souer等从矮牵牛中

克隆得到[2],随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中82中国烟草学报󰀁2010年12月第16卷第6期相继发现,目前在拟南芥和水稻中分别存在106和149

个NAC成员[3󰀁4]。研究表明,NAC转录因子在顶端分

生组织和花器官发育[1󰀁2,5󰀁6]、植物侧根发育[7󰀁9]、叶片

凋亡[10]、作物品质[11󰀁12]、次生壁形成[13󰀁14]和木质部形

成等生长调节过程[15],以及抵御多种生物和非生物胁

迫过程中均发挥重要作用。

NAC受多种生物胁迫和非生物胁迫的诱导表达。

目前,已经从多种植物中分离鉴定得到与抗逆相关的

NAC转录因子。Tran等采用酵母单杂技术从拟南芥中

分离到3个NAC基因ANACO19,ANAC055,ANAC072,

它们的表达受干旱、高盐和ABA的诱导,过量表达3

个基因中的任何一个都可以增强植株的耐旱能力[16]。

水稻抗旱耐盐基因SNAC1,其主要在气孔的保卫细胞

中被诱导表达,当植株受到干旱胁迫时,基因的表达促

进气孔关闭,但是不影响光合速率,因而抗旱性大为提

高。在生殖生长期遭遇严重干旱的情况下,过量表达

SNAC1的转基因植株结实率较对照提高22%~

34%[17];ATAF1是最早发现的NAC转录因子之一,其

功能一直未知,Lu等证实了ATAF1为干旱诱导型基

因,它的表达受干旱胁迫和ABA处理的诱导,而在水

处理下受到抑制。敲除该基因的突变体ataf1,在干旱

胁迫后的恢复反应测试中,恢复率是正常对照的7倍,

同时,已知的干旱诱导型基因(RD17、ERD10、KIN1、

RD22、COR78和LT178)表达水平提高,这些结果说明

ATAF1基因作为负调控转录因子,通过下调抗逆相关

基因的表达在胁迫反应中起作用[18]。水稻OsNAC6

的表达不但受到干旱、低温、高盐等非生物胁迫的诱

导,还受机械损伤和稻瘟病的诱导,过量表达该基因的

水稻提高了对干旱,高盐及稻瘟病的耐受力,但是表现

出生长阻滞和低产[19]。Oh等从辣椒中分离到NAC类

转录因子基因CaNAC1,该基因受病原菌快速特异诱

导,同时受外源水杨酸和乙烯的强烈诱导表达[20]。

Delessert等发现拟南芥转录因子ATAF2在叶片损伤部

位高表达,并对损伤植物中的激素甲基茉莉酮酸和水

杨酸诱导作出响应,超量表达ATAF2的转基因植株对

土生镰刀霉菌敏感性增强,说明ATAF2作为病原相关

蛋白的负调控子在防御反应中起作用[21]。Selth等证

实在复制增强子的作用下,番茄缩叶病毒诱导SINAC1

在染毒细胞中特异表达,过量表达SINAC1导致TLCV

病毒DNA大量积累,说明SINAC1在复制增强子增强的TLCV复制中起重要作用[22]。在白粉病毒注射过程中,Jensen等对大麦HvNAC6进行基因沉默的研究证

明,大麦表皮细胞形成对白粉病毒性细胞的渗透抵抗,

另外研究证实该基因的同源基因ATAF1也可以被白

粉病毒诱导[23]。

DREB转录因子属于AP2/EREBP转录因子家族,

它能与核心序列为5󰀁󰀁CCGAC󰀁3󰀁的脱水响应元件

(DRE,dehydrationresponsiveelement)或者类似DRE的

序列CRT结合,参与干旱、高盐等胁迫应答反应,在逆

境胁迫调控中起重要作用[24󰀁25]。

本研究从小麦中克隆得到1个NAC转录因子基

因󰀁TaNAC,通过在烟草中过量表达TaNAC基因研究

了该转录因子抵御干旱胁迫的能力,为烟草育种提供

了参考。

1󰀁材料与方法

1󰀁1󰀁材料小麦京冬17(TriticumaestivumL.)为北京杂交小

麦工程技术研究中心培育的冬小麦抗旱品种,根癌农

杆菌C58C1,烟草(NicotianatabacumL.)W38本实验室

保存。

1󰀁2󰀁样品处理

将25󰀁光照培养2周左右的小麦󰀁京冬17󰀁植株

进行干旱、高盐、低温胁迫处理,具体步骤如下:干旱处

理:将小麦幼苗整个植株从盆中移出,用蒸馏水将根部

泥土冲洗干净,滤纸吸净根部水分后,植株置于滤纸上

进行快速干旱胁迫处理;高盐处理:将小麦幼苗置于

200mmol/LNaCl溶液中,室温;低温处理:将小麦幼苗

置于4󰀁培养箱中,以上胁迫反应分别在处理0h、lh、

2h、5h、10h、24h后取样,迅迅速置于液氮速冻,󰀁80󰀁

保存备用。

1󰀁3󰀁TaNAC基因的克隆

根据北京天根生化科技有限公司提供的方法完成

植物叶片组织的总RNA提取,之后以提取的总RNA

为模板,以AP(5󰀁󰀁GGCCACGCGTCGACTAGTAC

TTTTTTTTTTTTTTTTTT󰀁3󰀁)序列为引物、用RevereTran󰀁

scriptase(M󰀁MLV)进行反转录,得到用于后续实验的

cDNA模板。同时,以水稻NAC家族基因为参照序列,

利用同源克隆的方法设计引物TaNAC󰀁F:5󰀁󰀁TCCCCC

GGGACCATGGAAGGGCTCGACGTC󰀁3󰀁;TaNAC󰀁R:

5󰀁󰀁TCCGAGCTCTTAATGGACACTTGCAGACGA󰀁

3󰀁。以混合cDNA为模板(得到每1种处理材料的cD󰀁83刘美英等󰀁TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能