２００８年第２期
生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ·综述与专论·
收稿日期：２００７－０９－３０作者简介：邢树礼（１９８３－），男，山东临沂人，硕士，研究方向：药物剂型研究通讯作者：赵帅（１９８３－），男，硕士研究生；Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｕｓｔｚｈａｏｓｈｕａｉ＠１６３．ｃｏｍ
序言Ｍｔ化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐，广泛
存在于生物中的低分子量，富含半胱氨酸，并能被金属诱导的金属结合蛋白［１］。由于它具有高的金属容量和特殊的生物结构，在金属蛋白中，它的作用比较显著。近年来，人们对它的研究日益深入，实验
证明，Ｍｔ与体内微量元素的储存，转运和代谢，机体的生长发育，衰老及某些疾病有关。此外，它还可以清除自由基，拮抗电离辐射，解毒重金属。目前，人们发现在生长的哺乳细胞中含有大量的Ｍｔ，它可能与致癌基因的产物相似，例如ａ－胎蛋白［２］。１Ｍｔ的分类和性质
它在哺乳动物中有４种Ｍｔ异构体即Ｍｔ－１，
Ｍｔ－２，Ｍｔ－３，Ｍｔ－４。其中，Ｍｔ－１和Ｍｔ－２存在于所有
器官中，Ｍｔ－３存在于脑组织中，Ｍｔ－４仅发现在鳞状上皮组织中。Ｍｔ是有一组基因编码构成的，它包括１０个官能团亚型［３］
。Ｍｔ－２Ａ基因编码Ｍｔ－２蛋白，而
Ｍｔ－１蛋白是由一系列Ｍｔ－１基因编码而成。Ｍｔ在细
胞的生长和分化过程中发挥着重要的作用，在生长的组织和赘生细胞中它的含量较高［４］。Ｍｔ与二价金属离子具有高亲和性，它的分子
量都为６￣７ｋＤａ，比一般蛋白质分子量低，Ｐｉ为３．９￣４．６，哺乳动物的Ｍｔ一般为６１￣６２个氨基酸残基，
组成的多肽链中含有２０个Ｃｙｓ，约占全部氨基酸的１／３，有６￣８个Ｌｙｓ，７￣１０个Ｓｅｒ［５］
。它含有巯基，可以
结合一定量的重金属，保护细胞和组织免受重金属
金属硫蛋白的功能及应用前景邢树礼王洪光赵帅（青岛科技大学化工学院，青岛２６６０４２）
摘要：金属硫蛋白（Ｍｔ）是科学家ｍａｒｇｏｓｈｅｓ和ｖａｌｌｅｅ发现的，它是一种低分子量，富含半胱氨酸可结合重金属的蛋白质，与调节细胞生长与增殖的金属调节蛋白有关，分布在哺乳动物组织器官中。人们为了能清肿瘤产生的过程，尝试了各种生物标记物，例如，癌基因、ｐ５３抑癌基因、ｗａｆ１蛋白质、多育细胞核抗原、端粒转移酶、小随体标记物。人们发现在人类各种肿瘤中都有分泌Ｍｔ，因此它也可以作为生物标记物。人们对Ｍｔ的检测是利用免疫组织化学的方法，将肝切片放置在用石蜡密封的冷丙酮中保藏，用抗生物素蛋白链菌素免疫过氧化物酶的方法进行检测。关键词：金属硫蛋白癌基因免疫组织化学检测法金属调节蛋白
ＦｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＰｒｏｓｐｅｃｔｓｏｆＭｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ
ＸｉｎｇＳｈｕｌｉＷａｎｇＨｏｎｇｇｕａｎｇＺｈａｏＳｈｕａｉ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＱｉｎｇｄａｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ２６６０４２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｓ（ＭＴｓ）ｗｅｒｅｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｉｎ１９５７ｂｙＭａｒｇｏｓｈｅｓａｎｄＶａｌｌｅｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｌｏｗ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌｒｉｃｈｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＩｔｉｓｎｏｔｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇｔｈａｔｍｏｓｔｍａｍｍａｌｉａｎｔｉｓｓｕｅｓｃｏｎｔａｉｎａｇｅｒｅｌａｔｅｄｂａｓａｌｌｅｖｅｌｓｏｆＭＴｓｓｉｎｃｅｔｈｅｙａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｅｔａｌｌｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｃｅｓｓｅｓｔｈａｔｉｎｃｌｕｄｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎａｎｅｆｆｏｒｔｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｉｓｉｎｔｒｉｇｕｉｎｇｔｕｍｏｒ，ｖａｒｉｏｕｓｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｓｕｃｈａｓｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ｐ５３ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅ，ｗａｆ１ｐｒｏｔｅｉｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ，ａｎｄｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｓａｎｄｈａｖｅｂｅｅｎｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｓ（ＭＴｓ）ｗｈｉｃｈｈａｓｒｅｃｅｎｔｌｙｓｈｏｗｎｔｏｂｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｖａｒｉｏｕｓｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｓ．ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭＴｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｃｏｌｄａｃｅｔｏｎｅ－ｆｉｘｅｄｐａｒａｆｆｉｎｅｍｂｅｄｄｅｄｌｉｖｅｒｓｅｃｔｉｏｎｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｔｈｅｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｍｅｔｈｏｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＭｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｓＯｎｃｏｇｅｎｅｓＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎＭｅｔａｌｌｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００８年第２期
的毒害。此外，Ｍｔｓ含有大量细胞必需的重金属，如锌，铜。Ｍｔ中巯基可以与金属离子可逆结合，便于金属离子在机体组织的交换。它存在与不同类型的真核生物中，可以作为抗氧化剂清除自由基，降低自由基对细胞的毒害。２Ｍｔ与肿瘤癌变的过程是一个动态的过程，在此过程中基因的功能也发生了改变，时间是一个关键的因素，癌变的潜伏期几年甚至几十年，细胞中的遗传物质遭到癌变部分的持续进攻，当癌变部分积累到一定的程度时，基因的功能发生变化，导致突变的细胞无限繁殖。然而，大部分癌变的部分在前期并不会进一步恶化，反而会自动消失，这可能说明肿瘤的产生还与其它因素有关［６］。Ｍｔ与二价金属离子具有高的亲和力，多项研究表明，在正常增殖的细胞和癌细胞中，Ｍｔ的含量显著增加。Ｍｔ的高表达与癌细胞的生长有关。Ｍｔ的亲核性可以降低抗癌药物产生的亲电性对细胞的毒性效应，而Ｍｔ与细胞之间并不是通过简单的共价键结合的［７］。研究表明，将细胞暴露在抗癌药物中，提高Ｍｔ的表达量可以诱导细胞产生抗凋亡作用，而在缺乏Ｍｔ的细胞中，细胞的死亡率明显提高。在人乳腺癌细胞系细胞中，降低Ｍｔ的量，发现不仅可以抑制细胞的生长，还能诱发细胞的凋亡［８］。在正常的细胞中，Ｍｔ的表达量与对重金属离子的解毒量，细胞内微量元素的含量，自由基的清除量有关。Ｔｒｉｄｉｐ和Ｔｈｉｒｕｍｏｏｒｔｈｙ研究发现肝中微量元素的变化，ｋｉ－６７和Ｍｔ的表达量都可以作为癌症产生的先导标记物，０．５ｍｇ／ｋｇ的钒可以抑制２－ＡＡＦ诱发肿瘤。Ｍｔ蛋白质和ｋｉ－６７蛋白质的过量表达也与致癌的过程有关。在无癌变的大鼠肝脏中，钒可以抑制ｋｉ－６７和Ｍｔ的表达量。人们已经开始对Ｐ５３表达过程中钒的作用以及肿瘤的诱导过程进行重点研究［９］。此外，Ｍｔ可以作为浸润性导管癌，皮肤癌，乳腺癌的检测标记物。３Ｍｔ与人类病理生理学过程的关系３．１Ｍｔ的解毒作用Ｍｔ有稳定细胞内环境和对重金属的解毒作用。研究表明，Ｍｔ可以清除活性氧的代谢物，特别是羟基。当细胞中的抗氧化剂代谢失衡时，需氧代谢产生的有毒物质，可能会诱发ＤＮＡ的突变，脂质
的过氧化，酶的失活等，从而导致细胞结构的破坏，染色体的畸变，最终导致癌症的产生［３］。不过，人们也会采用电辐射，化学治疗以及光学治疗等方法治疗癌症。３．２Ｍｔ的双重作用
Ｍｔ对肿瘤细胞的生长、分化、修复都起着重要
的作用，同时，通过氧化应激来保护细胞免受吞噬作用。它可以被内源性和外源性刺激物诱导产生，例如，糖皮质激素，干扰素，白细胞介素，黄体激素，血清因子，重金属离子等。３．３Ｍｔ对抗癌药物的反应
人们发现，Ｍｔ的表达与抗癌药物诱导和肿瘤增殖有关。人们利用免疫组织化学的方法在组织中检测出Ｍｔ－１和Ｍｔ－２亚基。Ｍｔ的过量表达可能与恶性肿瘤和一些高度分化的轻度肿瘤有关［１０］。３．４Ｍｔ的过度表达
在实验中发现，Ｍｔ的过量表达可以使卵巢癌产生耐药性。这可能是因为药物的多价鳌合和代谢产物影响了药物与细胞特定靶位的结合，降低了抗癌药物的药效。这可能就是为什么开始对化疗敏感的肿瘤由于某些蛋白过量表达慢慢产生了抗药性。另一种原因可能是生长因子激活控制耐药性的酶和蛋白质的表达，从而使肿瘤产生耐药性。但是，他们都没有找到肿瘤的耐药性与细胞中某些蛋白过度表达的必然联系［１］。３．５遗传和非遗传毒性
人们容易受致癌化学物质遗传和非遗传毒性的影响。干细胞突变株和克隆突变扩增株可以作为癌症的替代品进行环境的安全评估。我们可以选择内生标记突变基因，如利用结肠小窝干细胞分泌的葡萄糖六磷酸脱氢酶，可以使小窝限制型发生显形转变［１１］。３．６Ｍｔ作为抗氧化剂
Ｍｔ具有抗氧化剂的作用，细胞中的氧化剂在
抗肿瘤药物中扮演重要的角色，它可以介导癌细胞的死亡，Ｍｔ的表达量可以被周围的氧原子的含量所控制。Ｍｔ可以作为诱导抗细胞凋亡的蛋白。Ｍｔ在癌变过程中发挥着重要的角色，涉及肿瘤细胞病理
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学和抗药性，人们还发现在肠癌和胃癌中，锰离子（Ｍｎ－ＳＯＤ）的含量明显增高［３］。此外，人们发现在ＭＴ含量较少的细胞里，ＤＮＡ容易受到损害，将它们暴露在诱导刺激物中，细胞的凋亡率明显提高，相反，对细胞进行适当的Ｍｔ诱导，在上面同样的条件下，可以减少细胞的死亡率。４影响Ｍｔ合成的因素多型基因控制Ｍｔ的合成，此外，金属，药物，激素，氧化应激等因素也可以诱导它的产生。肿瘤中Ｍｔ的水平还与耐药性有关。Ｍｔ可以调节细胞内锌和其它金属的浓度。Ｍｔ过度表达能够影响ＤＮＡ的转录，翻译和蛋白质的合成［１１，１２］。５Ｍｔ的免疫染色５．１阳性对照Ｍｔ蛋白免疫组织化学检测方法是将用石蜡密封冷丙酮储存的肝脏切片与抗生蛋白链菌素—卵白素－生物素－免疫过氧化物酶进行一系列的反应来实现的。将５μｍ的切片放在用聚左旋赖氨酸包裹的载波片上，去石蜡和再水合。将内源性过氧化物在含有１％双氧水的０．１ｍｏｌ／Ｌ喹啉盐（ｐＨ值７．６）放置３０ｍｉｎ使其失去活性。然后，加５％山羊血清在３７℃放置１ｈ，将切片中加入用１％ＢＳＡ按１：５０稀释的家兔抗大鼠Ｍｔ－１抗体并在４０℃过夜，再加二次抗体－山羊抗兔免疫球蛋白在３７℃放置３０ｍｉｎ并按１：２００稀释。在抗生蛋白链菌素过氧化物酶（１：１００）中放置１ｈ，随后用以含０．３３％双氧水的０．５ｍｏｌ／Ｌ喹啉氯化钠底物，０．５％＋３，３＇－二氨基二苯胺四盐酸进行染色，然后用哈里斯苏木紫复染，然后脱水，展开，并进行阳性对照［９］。５．２阴性对照阴性对照试验与上面的阳性对照试验步骤是一样的，只是没有添加主要的抗体。当肝脏中的细胞核和细胞质被染色时，Ｍｔ免疫染色是成阳性的，Ｍｔ免疫反应性是根据免疫阳性细胞的百分比来衡量的。从１０个高倍率领域随机挑选，阳性细胞量与这一区域的细胞总量有关［９］。６展望Ｍｔ的研究已有４０多年的历史，对其结构、特性、基因调控及生物学功能的研究日趋深入，研究成果已涉及医学、毒理学、环境科学、营养学、生物工程、美容护肤等各个领域，应用前景十分广阔，随