溶菌酶的知识应用与临床诊断与研究前景 作者：林鹭 地址：广西医科大学 一：摘要：本文主要介绍了溶菌酶的理化性质及分类，分离纯化方法，酶活

力测定方法，还介绍了溶菌酶在食品﹑医药上的应用及其最新研究进展。 二：关键词： 溶菌酶 分离纯化 活力测定 临床应用 研究现状 三：前言： 溶菌酶又称脆壁质酶或N 一乙酰壁质聚糖水解酶，是英国细菌学家弗莱明于1922 年在鼻粘液中发现的强力杀菌物质，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质，抗菌、抗病毒、抗肿瘤、无毒性的优点，使得溶菌酶在食品上和医药上都有广泛的应用，在生物技术中, 溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶, 可以说溶菌酶的发现是近代酶化学研究的最大成果之一[2]。这里通过对溶菌酶理化性质、分离纯化方法和应用的介绍，使大家对溶菌酶有更加清晰全面的了解，以便于对溶菌酶更深入地研究和探索。 四： 溶菌酶概述 1.1 溶菌酶分布[3] 溶菌酶名称起源于1922 年，Alexander Fleming 发现人的唾液、眼泪中存在一种可溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，就命名为溶菌酶。此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。溶菌酶广泛存在于动植物体内和人的外分泌液中。 1.2 溶菌酶分类[4] 国际酶学委员会根据其底物及作用特点又称其为酰胺酶或粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，编号E C3.2.1.17，与常见的蛋白酶、淀粉酶一样属水解酶系列。 根据其来源不同一般可将溶菌酶分6 类：C型(chicken)、G型(goose)、无脊椎动物型(invertebrate-type)、噬菌体、细菌和植物来源溶菌酶。不同来源酶的分子量、氨基酸组成及酶特性各有不同，但三维结构显示来源于共同的进化

起源。目前对C型溶菌酶研究较多，它是由129个氨基酸残基组成的一条多肽链，含有4对二硫键，三维结构为较紧密的椭球形，它广泛存在脊椎动物如哺乳动物、鸟、爬行动物及鱼类和无脊椎动物如昆虫、甲壳类中。微生物来源的溶菌酶较多，广义上一般分以下几类：①内-N -乙酰己糖胺酶，与卵白溶菌酶一样，能分解构成细菌细胞壁骨架的聚糖；②酰胺酶，能切断连接聚糖和缩氨酸的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸键；③内肽酶和蛋白酶，能分解细胞壁缩氨聚糖的缩氨酸键；④ β-l,3、β-1,6-葡聚糖酶和甘露糖酶(葡甘露糖酶)，能分解酵母菌细胞壁；⑤磷酸甘露糖酶，与β-1,3、β-l ,6-葡聚糖酶、甘露糖酶(葡甘露糖酶) 共同作用，能分解原生质；⑥壳多糖酶，与葡聚糖酶共同作用，能分解霉菌或酵母菌；⑦脱乙酰壳多糖酶，主要分解霉菌中的毛霉菌(Mucor) 和根(Rhizopus )。 1.3 溶菌酶基本理化性质及作用机理 ①溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白,化学性质非常稳定。当pH值为1.2～11.3范围内剧烈变化时,其结构几乎不变。在酸性环境中,溶菌酶对热的稳定性很强；当pH值为4～7100℃处理1 min仍能保持原酶活性;当pH值为3时能耐100℃加热处理45min;在干燥条件下,溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。黄色的结晶体或无定形粉末,无臭,味甜。易溶于水,遭碱易破坏,不溶于丙酮和乙醚[5]。 2 溶菌酶分离纯化 [7] 2.1 材料与方法 2.1.1 原料与试剂 鲜鸡蛋(市售)、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、丙酮、724型阳离子交换树脂等,以上药品均为分析纯。 2.1.2 主要仪器 分光光度计(7230G型)、搅拌器(200～300rpm)、离心(4000rpm)。 2.1.3 菌种 藤黄微球菌(Micrococcus luteus) 2.1.4 培养基 液体培养基:牛肉膏0.5g,葡萄糖0.1g, 氯化钠0.5g,蛋白胨1g, 溶于1L水中, 分装于三角瓶中,121℃灭菌15min。 固体培养基:牛肉膏5g, 葡萄糖1g, 蛋白胨10g,琼脂20g,置于1L水中,加热溶解, 分装于三角瓶中,121℃灭菌15min。 2.2 工艺流程 溶菌酶分离纯化的工艺流程如下图所示： 2.3 操作步骤 2.3.1 蛋黄与蛋清的分离 取新鲜的鸡蛋,去壳,经分离器后,使蛋清与蛋黄分离。打破蛋壳时应避免蛋黄破散,使两者完全分离。 2.3.2 蛋清的预处理 将分离后的蛋清加入到搅拌器中,200～300rpm下搅拌10min, 再将蛋清搅拌稠度均匀即可,以不引起发泡为宜。最后用2～3层纱布过滤,以除去残余蛋壳和少量蛋黄。 2.3.3 吸附 将过滤后的蛋清冷至5℃后移入搪瓷捅中, 然后在搅拌下加入已处理好的树脂(14%加入),使其悬浮在蛋清中,在0～5℃下,搅拌吸附5h,然后在0～5℃静置20h以上,等分层后,弃去上清液后的树脂用清水反复冲洗2～3次,以除去杂蛋白,最后晾干树脂,移入一个搪瓷缸中。 2.3.4 酶的洗脱 在上述树脂中加入同体积的0.15mol/L的pH6.5磷酸盐缓冲液,搅拌洗脱20min,过滤洗脱液,除去一部分杂质。再重复洗脱2次。将除去杂质的树脂加入等量浓度为10%的硫酸铵溶液,搅拌洗脱30min,滤出洗脱液,重复洗脱3次,滤出的洗脱液一起倒入沉淀缸中沉淀。 2.3.5 沉淀 在沉淀缸中按洗脱液的体积加入32%固体硫酸铵,搅拌使其溶解, 在4℃放置过夜。第2天,用虹吸法取出上清,4000rpm离心10min分离沉淀物。 2.3.6 透析 将沉淀物用蒸馏水全部溶解,然后放入透析袋中,在10℃水中透析过夜,以除去沉淀中的硫酸铵,收集透析液。 2.3.7 盐析 将透析液移入一容器内,用0.1mol/L的NaOH调溶液pH至8.5～9.0, 有白色沉淀时,应立即离心除去沉淀。用2mol/LHCl调pH至3.5,搅拌, 并在0℃放置48h,同上离心收集沉淀物。 2.3.8 成品的干燥 将上述沉淀物加入到丙酮,搅拌,放置2h,收集沉淀,用冷冻干燥法干燥沉淀即得产品。干燥的溶菌酶可在室温下长期保存。其纯品为白色或微黄色的结晶体或粉末,无臭,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。 3： 酶活力测定方法[9] 3.1 底物的制备 将微球菌接种于液体培养基扩大培养(28℃,24h),再接种于固体培养基培养( 28℃,48h),用无菌水将菌体洗涤, 4000rpm 离心10min, 弃上清,再洗菌体数次, 最后用少量无菌水制成悬液, 冷冻干燥即得干菌粉。取干菌粉5g,加入少量0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液置于匀浆器或研钵中研磨2min, 倾出并稀释至20～25mL,悬液的光密度OD450在0.5～0.7范围为宜。 3.2 酶液的制备 准确称取干溶菌酶粉5mg,用0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液溶解成0.05mol/L酶液。 3.3 酶活力测定 将酶液与底物悬液分别置于25℃水浴中保温10～15min, 测底物悬液的OD450 值,作为对照。然后加入酶液0.2mL(约10μg酶蛋白)迅速摇匀。从加酶时开始记时, 每30s测1次OD450值,共测3次。 3.4 酶活力的计算 以每毫克溶菌酶每分钟使吸光度降低0.001个单位为1个酶活力单位。溶菌酶活力=ΔOD450/(0.001×W)(U/mg) 式中, ΔOD450 为450nm 处每分钟吸光度的变化；W为加入的酶量(mg)。 五：小结与讨论 关于酶的纯化上, 蛋清中溶菌酶的等电点在pH=10.8 左右, 在偏酸性和偏碱性溶液中, 其稳定性都比较好, 蛋清中其他蛋白杂质的等电点约在pH4.6～5.0 左右, 适量酸的添加既不会破坏溶菌酶, 又便于蛋白杂质的沉淀, 使溶菌酶得到分离纯化。对于酶活力的高低, 温度对其影响比较大, 温度低时产品纯度低, 导致酶活力降低; 而温度过高时, 可导致酶蛋白发生不可逆变性, 同样造成酶活力下降。所以温度控制要适当。除此之外, 酶活力还与酶的纯度相关。因此, 可在透折后用超滤工艺使酶液得到浓缩, 从而提高酶的比活力, 同时又可除去大部分蛋白杂质[10]。 六：溶菌酶在医药领域上的应用 溶菌酶可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药. 七： 溶菌酶应用的最新研究进展 7.1 溶菌酶固定化 将溶菌酶固定化在食品包装材料上, 生产出有抗菌功效的食品包装材料, 以达到抗菌保鲜功能。将溶菌酶固定化在HEPA(空气过滤器)上, 作为空调的空气净化系统, 使其具有高效除尘和杀菌两大功能。当空气通过滤网时, 先滤集捕捉尘粒和细菌,然后将捕捉到的细菌杀灭[15]。 7.2 生产低聚壳聚糖 用溶菌酶非专一性地降解海洋生物高分子壳聚糖, 使其成为能被人体吸收的低分子量具有独特生理活性和功能性质的低聚壳聚糖[16]。 八： 参考文献： [1] 罗晓薇.火焰原子吸收光谱法测定茶叶中的铅铜[J].现代仪器,2004,(03):30-32. [2]GB2757-1981 蒸馏酒及配制酒卫生标准[S]. [3][4] 马立保,程时军,张 伟.溶菌酶应用研究概况[J].新进展,2010(1):26-30. [5] 何金花,刘誉,刘冠杰.溶菌酶在医药中的应用及其研究进展[J].药展,2008(2):02-04. [6] 李鹤,马力,王维香.溶菌酶的研究现状[J].食品研究与开发,食品研究与开发,2008(1)12-14. [7] 史小利，李宗谦，徐淑霞.蛋清溶菌酶提取工艺研究[J].现代农业科技，2008（6）166-168. [8] 林亲录,马美湖.鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J].食品科学, 2002,2(23):43-46. [9]刘源岗,邓倩莹, 廖问陶.溶菌酶的活性测定[J].食品科技, 2005(10):71- 73. [10]张灏,赵玉萍,杨严俊.超滤法提取蛋清溶菌酶[J].无锡轻工大学学报,2002,6(21):607-612.