• 4.2.4 计算结果 • X=W*N*1 000／(t*M) • X：酶活力单位，U／mL； • W：用半乳糖标准曲线回归方程计算出相应 的还原糖的质量，mg； • N：酶液稀释总倍数； • 1000：将毫克换算成微克的换算系数； • t：反应时问，min • M．-样品的量，mL
5 卡拉胶酶的分子生物学研究
卡拉胶低聚糖具有多种生物活性，可以抗肿 瘤、治疗胃溃 疡和溃疡性结肠炎、进行免 疫调节、抗凝血等
卡拉胶的黏度很大，添加卡拉胶酶以后使卡 拉胶很快降解，黏度下降，大大方便了 DNA 的提取
• 1个卡拉胶酶活力单位(u)定义为50 ℃ ，pH 6．20，每l min产生lg还原糖(以半乳糖计) 所需要的酶量
2 卡拉胶酶的性质
• 2.1 酶学性质 • 用硫酸铵沉淀，离子交换色谱，凝胶过滤 色谱(G-200)纯化得到 κ卡拉胞酶，纯化的 酶分子量用SDS／PAGE电泳测定为 100000， 卡拉胶酶的最适pH为7．6，最 适温度为25℃ 。金属离子对Cytophaga， lk-C783生长的影响，NaC1和MgCl2可被细 菌利用，2216E中培养基最小浓度0.05mol ／L NaC1，0．25MgC12[7]。 KC1和 CaC12对产酶没有作用，当营养物质充足的 时候，卡拉胶酶在休眠和生长的细胞都可 合成和释放。
6 卡拉胶酶应用研究
• 1 在卡拉胶结构研究中的应用 • 2 制备卡拉胶低聚糖 • 3 作为海藻遗传工程的工具酶
。
• 4 用于研究细菌的卡拉胶代谢
• 采用磺化的方法进行化学修饰后，获得带 有不同硫酸基含量的低聚糖衍生物。 • 6.3 作为海藻遗传工程的工具酶 • Gross等1990年利用carrageenovora卡拉 胶酶和其他细胞壁降解酶共同作用，制备 海藻原生质体，提高了海藻细胞原生质体 的产量，并简化了提取过程。卡拉胶酶还 用作海藻解壁酶，以获得DNA，单细胞， 蛋白质和原生质体。卡拉胶的黏度很 大．使得提取DNA非常困难，添加卡拉胶 酶以后使卡拉胶很快降解，黏度下降，大 大方便了DNA 的提取。
3 卡拉酶新研究
• 3.1 卡拉胶酶的结构研究 • 通过x一射线衍射和多波长不规则衍射(MAD) 技术，发现它折叠成一个弯曲的β-三明治，球 状结构几乎全部由β一折叠和表面loop组成， 其中每一个β一折叠片层由6或7个β链组成， 2000年Michel等又对A．fortis L一卡拉胶酶的 晶体结构进行了分析 ，该酶折叠成右手平行 的β一螺旋结构，由10个完整的转角和表面 loop组成；核心是三个平行的β一折叠片组成， 其中一个折叠片嵌于另外两个平面彼此垂直 的折叠片形成的凹槽。研究认为，在前者上 有寡糖存在，推测这个凹槽很有可能就是
• 2.2 作用机制 • 根据水解过程异头碳的构象是否发生改变， 可将糖苷水解酶的作用机理分为保持型和 倒置型[9]。1995年，Potin等人说明了κ-卡 拉胶酶是以保持异构构型的分子机制进行 水解的，且目前已经发现的GH-16家族的 糖苷水解酶作用机制均为保持型[10]同时， 对ι卡拉胶酶进行研究，发现它是通过异构 构型全部转换的方式降解 ι-卡拉胶，使其内 部的β-(1-4)连接断裂。2007年，Guibet等 人通过核磁共振氢谱分析，说明carrageenovora -卡拉胶酶的作用方式也是转 换型的分子机制[11]。
7、展望
1 卡拉胶酶的分类及来源
• 1.1 卡拉胶酶的分类 根据酶解底物的专一性质，可分为κ-卡拉胶 酶，ι-卡胶酶，λ-卡拉胶酶等。卡拉胶是由1， 3．B．D．吡喃半乳糖和l，4-0．D．吡喃 半乳糖交替连接而成的线性硫酸多糖，日 前所发现的卡拉胶酶大多数是 κ-卡拉胶酶， 只有2种 ι-卡拉胶酶和1种κ-卡拉胶酶。
卡拉胶裂解酶研究进展 Advances on Carrageenase Research
院 系： 药学院 专 业： 专升本药学 姓 名： 贾云莉 指导老师： 武玉永（讲师）
目录
• 1、卡拉胶酶的分类及来源
• 2、卡拉胶酶的性质 • 3、卡拉胶酶新研究
• 4、卡拉胶酶活性研究
• 5、卡拉胶酶的分子生物学研究 6、分子生物学研究
• 4.2 卡拉胶酶活力研究 • 4.2.1 酶活测定 • 卡拉胶被降解后粘度降，同时产生大量的还原糖， 有实验以卡拉胶降解后还原糖的产生量来定义卡 拉胶酶的活力。还原糖的产生采用DNS法进行测 定。 • 4.2.2 原理 • 碱性溶液中，3.5一二硝基水杨酸(DNS)与还原糖 共热后被还原生成氨基化合物。过量的NaOH碱 性溶液中此化合物呈棕红色，540nm波长处有最 大吸收，比色法测定样品中含糖量 。
4 卡拉胶酶活性研究
• 4.1 卡拉胶酶降解产物 Potin等从红藻Delesseria sanguinea表面分离 到一株类噬纤维菌，用其κ卡拉胶酶对κ卡拉胶进 行充分酶解，C-NMR分析酶解终产物是以κ新卡 拉四糖硫酸盐和κ新卡拉六糖硫酸盐,VibrloCA1004能够产生大量的胞外X．卡拉胶酶对κ卡拉 胶和新卡拉胶寡糖硫酸盐能够产生水解作用，形 成以新卡拉二糖硫酸盐和新卡拉四糖硫酸盐为主 的产物。 2003年牟海津通过Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析技术对卡拉胶的酶解终产 物进行纯化，该酶专门水解3.6-内醚-D-半乳糖和 D-半乳糖之间的β-1.4糖苷键，最后形成以κ新卡 拉四糖硫酸盐和κ-新卡拉六糖硫酸盐为主。
1.2 卡拉胶酶主要来源 较多的来源于微生物和海洋动物。微生物 来源的卡拉胶酶, 目前已从假交替单胞菌属 噬纤维菌属、交替单胞菌属(Alteromonas carrageenovora) 弧菌(VibfioZo – belliagala ctanovorans)和假单胞菌属(Pseudo monas Carageeno vora)等中发现卡拉胶酶，部分 报道表明，用海洋软体动物中的水解 酶(其中有卡拉胶酶)处理皱渡角叉菜 (Chondrus crispus)提取多糖。
• 4.2.3 测定方法 • 用0.05 mol／L，pH 6.20磷酸缓冲液配成 0.4％卡拉胶溶液，取2 mL于50"C预热10 min，加入l mL一定浓度的卡拉胶酶液，反 应l h后，加入2 mLDNS，立即在沸水中煮 2min终止反应并显色。同样条件下，以灭 活的酶液为对照，扣除相应的吸光度。冷 却后立刻测吸光值，然后由标准曲线得出 由酶降解产生的还原糖的浓度。1个卡拉胶 酶活力单位(u)定义为50―C，pH 6．20条件 下，每l min产生lg还原糖(以半乳糖计)所需 要的酶量。
• 至今为止，少数几种卡拉胶酶的基因得到 了克隆和测序。2000年，Barbeyron等对 galac—tanovor段，对其核苷酸序列和蛋白质序列 进行分析、同源性比较，发现两种酶的同 源一致性达43％，相似性为59％。2007年， Guibet等克隆和定序了carrageenovora产生 的λ-卡拉胶酶的cglA基因[16]。研究证实， 虽然作用底物为不同类型的卡拉胶，但卡 拉胶酶的氨基酸序列，底物特异性都存在 很大的差异。
7 展望
• 研究发现卡拉胶寡糖具有抗病毒、抗肿瘤、 免疫调节及抗凝血等药理活性，有望成为 新一代的海洋药物。卡拉胶降解菌分布广， 主要存在于海洋中，在土壤、淡水中较少。 由于海洋环境的特殊性，我们对海洋细菌 的了解和研究还很不够,随着新的卡拉胶降 解菌的不断发现和高活性、高表达的卡拉 胶酶研究不断深入．功能酶学、功能基 组 和蛋白质组的迅速发展，将为利于卡拉胶 酶降解得到大量的具有活性功能的卡拉寡 糖，提供更广阔的空间。
• 底物的结合位点。和其他大部分β一螺旋蛋白一 样，ι-卡拉胶酶在N一末端区域存在一个两亲性 α-螺旋；不同的是，其C一末端区域是高度复杂 的，是运用了一种α/β折叠形式。 • 3.2 卡拉胶酶降解作用新机制 κ-卡拉胶酶和 ι-卡胶酶的活性中心均为隧道状 结构，从而保证多聚体糖链能够从此处通过。 这种环形结构使酶活性中心位于隧道内侧，以 保证酶在释放产物后仍然能牢固结合在多糖链 上，从而使酶的催化反应得以继续进行：这种 酶反应的可持续性性质是保证卡拉胶酶能有效 降解卡拉胶凝胶的关键凶素 。
6 卡拉胶酶应用研究
1 在卡拉胶结构研究中的应用
• κ -卡拉胶酶，ι -卡胶酶的活性中心均为隧道 状结构，从而保证多聚体糖链能够从此处通过。 这种环形结构使酶活性中心位于隧道内侧，以 保证酶在释放产物后仍然能牢固结合在多糖链 上，从而使酶的催化反应得以继续进行，这种 酶反应的可持续性性质是保证卡拉胶酶能有效 降解卡拉胶凝胶的关键因素 。 Michel等(2003) 用电子显微镜分析了ι-卡拉胶纤维的降解，表明 ι -卡拉胶酶属于行进型的糖苷水解酶。