酪氨酸酶活性抑制实验方法

一、试剂： 酪氨酸酶、酪氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、阳性对照（熊果苷粉末）、样品、去离子水

二、试剂配制：

1、磷酸盐缓冲溶液（PH=6.8）：先分别配制0.2M的磷酸二氢钠和0.2M的磷酸氢二钠。

0.2M磷酸二氢钠：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 去离子水；

0.2M磷酸氢二钠：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 去离子水；

取51ML磷酸二氢钠+49ML磷酸氢二钠即得0.2M、PH=6.8的磷酸缓冲液。

2、L-酪氨酸溶液：称取L-酪氨酸25.6 g，用磷酸缓冲液定容于50mL容量瓶中，即得L-酪氨酸溶液。

3、酪氨酸酶溶液：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1：1（ W:V ）的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2h内用完。

4、受试液的配制：将原先所配5mg/ml的溶液用甲醇稀释到1mg/ml.。

5、阳性对照：取熊果苷粉末0.01g，溶于10ml的甲醇溶液，即得1mg/ml的对照品溶液。

三、实验方法：

依下表所示向试管中依次加入磷酸盐缓冲溶液、样品溶液、酪氨酸溶液，于35℃水浴10分钟。然后加入酪氨酸酶液，混匀，再在35 ℃下孵育30min，迅速转移至比色皿中，在475nm处测定吸光值。

组别

试剂 受试液组

阴性对照

组

阳性对照

组

空白对照组

1 2 3

缓冲液（ML） 1.0 1.5 1.0 3.5 4.0 3.5 受试液（ML） 0.5 0 0 0.5 0 0

酪氨酸（ML） 2.5 2.5 2.5 0 0 0

熊果苷（ML） 0 0 0.5 0 0 0.5

35℃水浴10min

酪氨酸酶（ML） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

受试组用空白对照组1调零，阴性对照组用空白对照组2调零，阳性对照组用空白对照组3调零。

受试组吸光值为A1，阴性对照组吸光值为A2，阳性对照组吸光值为A3。

抑制率=1－[（A1－A2）/(A3－A2)]×100%=（A3－A1）/(A3－A2)×100%

注：受试液组共四种样品